In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon
Summary
Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Abstract
nervi afferenti non solo forniscono informazioni relative normale fisiologia, ma anche segnale omeostasi disturbato e processi patofisiologici dei diversi organi dalla periferia verso il sistema nervoso centrale. Come tale, l'aumentata attività o 'sensibilizzazione' dei nervi afferenti mesenterici è stato attribuito un ruolo importante nella fisiopatologia dell'ipersensibilità viscerale e sindromi da dolore addominale.
Mesenterica attività del nervo afferente può essere misurata in vitro in un segmento intestinale isolato che è montato in un bagno per organi appositamente costruito e da cui il nervo splancnico è isolato, consentendo ai ricercatori di valutare direttamente attività nervosa adiacente al segmento gastrointestinale. L'attività può essere registrata al basale in condizioni standardizzate, durante la distensione del segmento o dopo l'aggiunta di composti farmacologici consegnati via endoluminale o serosally. Questa tecnica permetteil ricercatore di studiare facilmente l'effetto di farmaci destinati al sistema nervoso periferico nei campioni di controllo; inoltre, fornisce informazioni cruciali su come neuronale attività è alterato durante la malattia. Va notato, tuttavia, che la misura afferenti l'attività neuronale costituisce solo una stazione di rilancio del complesso neuronale cascata di segnalazione, ed i ricercatori dovrebbero tenere a mente di non trascurare l'attività neuronale in altri livelli (ad esempio, gangli spinali, midollo spinale o centrale del sistema nervoso ) al fine di chiarire completamente il complesso fisiologia neuronale in salute e malattia.
applicazioni comunemente utilizzate comprendono lo studio dell'attività neuronale in risposta alla somministrazione di lipopolisaccaride, e lo studio delle attività del nervo afferente in modelli animali della sindrome dell'intestino irritabile. In un approccio più traslazionale, il segmento isolato mouse intestinale può essere esposto a supernatanti colon da pazienti affetti da IBS. Inoltre, una modificadi questa tecnica è stato recentemente dimostrato di essere applicabile in campioni umano del colon.
Introduction
segnalazione sensoriale e la percezione del dolore è un processo complesso che deriva da una complessa interazione tra nervi afferenti, i neuroni spinali, ascendente e discendente percorsi facilitatori e inibitori e diverse regioni del cervello differenti. Come tale, modifiche in uno o più di questi livelli possono provocare segnalazione sensoriale alterata e dolore viscerale negli stati di malattia. Per studiare tutti questi diversi aspetti della segnalazione sensoriale più tecniche sono state sviluppate che vanno da esperimenti sulle cellule singole (ad esempio, l'imaging del calcio sui neuroni) per modelli animali interi (ad esempio, le risposte comportamentali, come la risposta visceromotoria). La tecnica descritta in questo documento permette ai ricercatori di valutare in concreto l'attività del nervo afferente in vitro da un segmento isolato di piccolo intestino o colon nei roditori. In breve, un isolato segmento gastrointestinale (di solito digiuno o del colon) è montato in una camera di registrazione costruito appositamente perfusi con K fisiologicasoluzione Rebs. Il nervo splancnico è sezionato libero e collegato ad un elettrodo che permette la registrazione dell'attività neuronale afferenti a nervi afferenti splancnici o pelviche. L'attività del nervo può essere registrato basale o in risposta alle crescenti pressioni intraluminali e / o composti farmacologici che possono essere applicati direttamente nella camera di registrazione (serosally), o tramite il perfusato endoluminale (mucosally) per valutare il loro effetto sul discarico afferente 1-6 . Da segnalare, nervi splancnici contengono anche fibre efferenti e afferenze viscerofugal in aggiunta alle afferenze sensoriali. Uno dei principali vantaggi di ex vivo registrazione nervo splancnico è il fatto che i ricercatori possono quantificare l'attività del nervo senza modulazione o ingresso dal sistema nervoso centrale, che permette di studiare l'effetto diretto dei composti applicati localmente sulla attività del nervo. Inoltre, il monitoraggio dei parametri vitali, come è necessario, utilizzando l'approccio in vivo (vedi sotto), è no è più rilevante. In vitro registrazione splancnico è finalmente molto meno in termini di tempo rispetto al suo omologo in vivo.
Afferent attività neuronale in risposta ad altri stimoli, come mucosale carezze, tastatura utilizzando peli von Frey o allungamento del segmento, può essere studiata in una configurazione sperimentale modificata, in cui il tessuto intestinale viene immobilizzato e aperto longitudinalmente (che è in contrasto la nostra messa a punto utilizzando un segmento intatto), come è stato descritto in un numero precedente 7,8. Inoltre, solo di recente, una tecnica è stata descritta per studiare attivazione nervosa afferente del colon nella stessa parete del colon tramite l'imaging di calcio, ancora una volta con un immobilizzato, longitudinalmente aperto segmento 9.
Una versione alternativa di questa tecnica in vivo consiste di misurazione attivazione neuronale in prossimità dell'ingresso del afferente nel midollo spinale. In breve, l'animale sedato viene posto in posizione prona, exposing il midollo spinale lombosacrale cui afferente nervo progetti di interesse mediante laminectomia, costruendo una paraffina pieno pozzetto utilizzando la pelle dell'incisione e copertura del rootlet dorsale su un elettrodo di platino bipolare 10,11. Questa tecnica permette inoltre ai ricercatori di caratterizzare le fibre in base al loro velocità di conduzione, e distinguono fibre C amieliniche da sottili mieliniche Aδ fibre. Inoltre, radichette dorsali contengono esclusivamente fibre afferenti sensoriali, in contrasto con i afferenti ed efferenti nervi splancnici misti citati in precedenza.
Registrazione afferente scarico nervoso in vitro da segmenti intestinali isolate può anche essere fatto usando campioni umani, come due gruppi di ricerca pubblicati in modo indipendente prime-in-man manoscritti registrazione del colon attività del nervo afferente a resezione umana provini 12,13. L'attuazione di questa tecnica potrebbe risultare in un più facilmente translatisu dei dati murini allo stato umano, e potrebbe consentire ai ricercatori di identificare facilmente farmaci destinati al nervo sensitivo sensibilizzata. L'importanza clinica di caratterizzare l'attività afferente del nervo, così come la scoperta di nuovi reagenti terapeutici che hanno come target esorbitante attività del nervo afferente, è stato elaborato discusso da molti esperti nel campo 14-19.
Il suddetto tecnica in vitro integra il più comunemente noto nella misurazione vivo di attività afferente del nervo. Durante la misura attività neuronale in vivo, attività nervosa può essere misurata direttamente nell'animale sedato durante il quale viene identificato il segmento di interesse e intubato in seguito, e un liquido di paraffina riempito pozzo è costruito utilizzando la parete addominale e la pelle del roditore 20. Il nervo afferente di interesse viene identificato, sezionato e posto su un elettrodo di platino bipolare, consentendo MISURE attività neuronalet. Questa tecnica permette al ricercatore di modulare l'attività del nervo afferente a vivere anche se gli animali sedati; come tale, si può studiare l'attività neuronale rispondere alle interferenze come distensione luminale o la somministrazione endovenosa di un composto.
Ricerca traslazionale si concentra oggi principalmente sull'applicazione dei surnatanti di derivazione umana (ad es., Da biopsie del colon, le cellule mononucleate del sangue periferico coltivate, ecc) su afferenze digiunali e / o del colon del mouse 21,22. I ricercatori possono applicare direttamente surnatanti o nel bagno di organo o nella soluzione endoluminale che perfuses il segmento intestinale, in modo che gli effetti differenziali della sierosa rispetto dell'applicazione della mucosa possono essere studiate sul discarico nervose afferenti. Come tale, è stato dimostrato che le colon supernatans biopsia della mucosa di pazienti con sindrome dell'intestino irritabile possono causare ipersensibilità nel topo afferenze del colon, cavia neuroni sottomucosi e la radice del mouse dorsalineuroni gangliari 21,23,24.
Infine, la registrazione dell'attività neuronale non è limitata alla mesenterica e / o neuroni pelvici innervano il tratto gastrointestinale. Altri hanno dimostrato che le registrazioni nervose possono essere eseguite in afferenti fornitura del ginocchio 25, mentre altri hanno caratterizzato vescica attività nervosa afferente e 26-28, e ha dimostrato che afferenze pelvici dalla vescica e anche il tratto gastrointestinale convergono, possibilmente con conseguente neuronale crosstalk 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo in questo documento descrive una tecnica di laboratorio riproducibili per studiare mesenterica attività del nervo afferente nei roditori usati per il nostro gruppo e altri 3,4,7,8,12,20,21,31. Passaggi critici all'interno del protocollo includono l'isolamento rapido del tessuto, l'aspirazione del filamento nervoso nell'elettrodo di aspirazione e l'adeguata 'tenuta' del capillare di vetro dal bagno per organi aspirando tessuto adiposo circostante nel capillare. L'…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
Materials
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
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