通过酶联凝集素测定来测量神经氨酸酶流感抑制抗体滴度

禽流感的元器件均重配病毒，必须使用生物安全2级（BSL2）的批准，由农业部美国农业部（USDA）和生物安全委员会使用的实验室 – 增强的做法来处理。 1.试剂和起始材料的制备注：请参阅材料表 ，以获得所有试剂的来源。 胎球蛋白包被的板通过混合用90ml10毫升10X包被缓冲液制备涂覆缓冲液的去离子H 2 O 制备胎球蛋白在25毫克/毫升，在500微升等份1X包被缓冲液并贮存在-20℃的母液。 通过稀释原液1000倍在1×涂层缓冲器准备立即涂装板前胎球蛋白（25微克/毫升）的工作溶液。 使用多道移液器以分配100μl的胎球蛋白的工作溶液到人具有高蛋白质结合能力的96孔平板l的孔中。 盖上板密封各板，然后堆叠在板中的10组，并在箔包裹它们。 进行检测之前将平板在冰箱（2-8℃）至少18小时。 注意：将板可以涂覆预先并存储在2-8℃的涂覆溶液达2个月。 稀释剂以制备稀释液，使病毒和样品稀释液（2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES），pH为6.5，20mM的氯化钙 ，1％牛血清白蛋白（BSA）和0.5％吐温20），混合94.2毫升1X MES，用2ml的CaCl 2（10毫克/毫升）pH为6.5，3.3毫升30％的BSA和0.5毫升吐温20。 以制备用于PNA-HRPO（MES，用20mM的CaCl 2和1％BSA pH6.5）中的稀释液，用2毫升氯化钙 （10毫克/毫升）混合94.7毫升1×MES，pH 6.5的，和3.3毫升30％BSA的。 神经氨酸酶（NA）的注：H6Nx病毒reassortants，产生（这些具有H6亚型HA和感兴趣的NA）的下列公开的方法5,10。从合作者请求灭活重组病毒的小瓶，如果他们不是在内部使用。当使用灭活的病毒，确认该制剂适合于通过示范在ELLA使用该灭活过程并没有对NA活性的显著影响。 培养H6Nx病毒在鸡胚11股票和存储整齐尿囊液以0.5ml等份在-80℃。 使用病毒的新等分试样用于每个试验。不要冻结和解冻的等分。 血清样品和对照热灭活所有血清（测试样品如前和接种后的血清，以及作为对照， 例如 ，样品与已知的NI滴度）的在56℃水浴中45-60分钟。前或热处理后储存在-20至-70℃的血清。如果SAMP莱要重复测试，冷冻，以使样品不重复冷冻和解冻之前做出几个等分试样。 使用ELLA测量是在合理的可供数量（> 5毫升）的人血清的NI滴度，以确定至少一个与低滴度和另一个具有高滴度。存储100微升等份作为≤-20℃，以使相同的样品可以用作以跟踪测定性能在许多测定法的对照。 花生凝集素（PNA） – 辣根过氧化物酶（HRPO） 制备PNA-HRPO稀释剂（MES，用氯化钙2和1％BSA pH6.5）中。 通过在1ml稀释剂的1毫克的PNA-HRPO溶解制备PNA-HRPO原液。存放于-20°C 20-200微升等分。 500，1：750 1：1000和1：使用新的PNA-HRPO很多，测试前1 2000稀释该试剂，以确定导致最大外径与阳性对照的量的（病毒只）和背景（没有病毒）笔帽是<阳性信号的10％。 作出2.1节所述一式四份病毒稀释。 转移稀释到胎球蛋白包被的板作为在第2.2节中所述，在37℃下孵育板。 16-18小时后洗涤板，并添加1：500 1：750 1：1000和1：2000稀释的PNA-HRPO（100微升/孔）到复制板的行。 如步骤2.3.4所述2.3.9完成检测。 查看数据来选择，导致了> 10倍背景的最大信号稀释。 在使用前，立即准备PNA-HRPO的最佳稀释1.5.3鉴定。 制备大体积的洗涤缓冲液（0.01M磷酸缓冲盐水（PBS），pH值7.4，0.05％吐温20（PBS-T））的。存放在室温下。 准备过氧化物酶底物（邻苯二胺二盐酸盐（OPD））：注：另一种过氧化物酶底物如3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB），也可以使用通过在试验当天溶解在100毫升的dh 2 O 1胶囊制备磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液。 使用前立即溶解在20毫升的磷酸盐柠檬酸盐缓冲液的1 OPD片剂（10毫克）。 制备终止溶液（1 NH 2 SO 4）27.2 ml储备98％的H 2添加SO 4至973毫升卫生署2 O.混合，然后在室温保存。 2. NA量的测定中使用ELLA 制备病毒稀释在96孔平板免除120微升样品稀释液（1.2节）为列稀释板1-11。 以第1列，增加一个额外的96微升样品稀释液。 解冻，然后加入24微升复制在第1列孔中这给出1:10稀释病毒的前涡旋病毒的小瓶中。 使样品稀释病毒的系列2倍稀释液，通过转移120微升从一个井每个稀释度下一次使用干净的枪头。 转移病毒稀释到胎球蛋白包被的板用PBS-T（1.6节）洗胎球蛋白包被的板3次，然后吸干各板放置吸水纸巾以除去任何过量的洗涤缓冲液。 1添加50微升样品稀释液（1.2.1节）向每孔中的列的胎球蛋白包被的板11。 加入样品稀释液列12 100微升（这些井都是阴性对照）。 转印稀释的病毒的50微升从列稀释板1-11的胎球蛋白包被的板的相应孔中。 盖上板密封该板，然后将其放置在湿润的培养箱中在37℃。 记的在这余下的步骤将被执行（16-18小时后）的时间。 完成NA测定当孵育完成后（16-18小时），转移板块在板凳上，取下板盖。 用PBS-T（1.7节）洗涤该板6次，然后反转和在吸水纸巾轻拍，以确保所有液体已经被从孔中除去。 添加100μl/孔的PNA-HRPO溶液（在1.5.3中确定的稀释度）至所有孔中，并孵育该板在RT 2小时。 不到15分钟前的孵化结束，如1.7节的介绍准备OPD解决方案。 洗试验板3次，以除去PNA-HRPO并加入100微升OPD底物的向每个孔之前吸干。 将培养板在RT恰好10分钟。 停止加入100微升/ 1N的硫酸孔中的反应。 使用平板读数器测量490nm处的光密度（OD值）为0.1秒。 保存并导出所有数据文件。 选择将用于血清学检查病毒稀释画绘出OD 490nm处的图</sUB>在每个病毒稀释度值。检查滴定曲线来确定的最大信号（这通常是对应于高原在滴定曲线的开始的信号），最小的信号（即包含在板的12列中没有病毒提供背景对照孔），和病毒的导致在外径是正比于输入稀释（ 即，曲线的线性区域）的稀释液。 选择该病毒稀释度给出了最大信号的约90％，并且是线性的范围内。确认在所选择的稀释的外径为至少10倍于背景信号大。使用选定的病毒稀释于采用这种特殊的病毒股票的所有检测。 注意：可替换地，测量病毒的NA活性和在ELLA使用〜15-20μUNA活性/毫升。 3.酶联凝集素测定法注： 图2笑WS稀释和测定板的设置。 使样本稀释放置在冰上的热灭活样品。 注：8血清可以在每个板中稀释。 对于设置使用在开始各板块全线1:10稀释，再加入120微升样品稀释液中列3-11所有孔。 到第2列，加样品稀释液216微升，每个样品的24微升。通过上下吹打3次在混合井的样品，然后转移120μl到下一列。 改变枪头后，上下吹打混合井的内容，然后转移120μl到下一列。 重复步骤3.1.4直到样品已被转移到塔11，剩余的120微升丢弃。 加样品及病毒的胎球蛋白涂层板解冻病毒，涡流的小瓶中并悬浮病毒在于在步骤2中选择的稀释稀释剂（1.2节）。4.2。至少准备5毫升病毒为每个测定板。保持稀释的病毒在冰上，直到洗涤板和血清样品已被添加到该板。 决定所需要的用于测定胎球蛋白包被的板的数量（一般也适用每板4的血清）。用PBS-T洗胎球蛋白包被的板3次，然后反转每个板并吸干到吸水纸巾以除去过量的洗涤缓冲液。 使用多道移液器，从稀释板转移50微升每个血清控制或样品稀释成复孔列2-11。 加入50μl稀释的病毒的所有孔，除了阴性对照组（第12列）。 加入50微升样品稀释液对井1列，并添加100微升样品稀释液中列12。 盖上板密封的孔，然后通过轻轻拍打板的侧面，或在中等速度放置在板振荡器上持续10秒混合。 放置板在一个humidif在37℃下16-18小时IED孵化器。 添加PNA-HRPO并完成试验在2.3节中描述 4.数据分析确定化验结果的有效性确认该背景值（无病毒）是阳性对照（病毒和无血清）的小于10％。 确认对照血清运行在不同的测定使用相同的条件下，效价中的中位数滴度的2倍。 确认控制井的OD测量是一致的（≤20％不同），并一式两份样品孔的OD测量是一致的（≤10％不同）。 确定无效结果的根本原因并重复检测，如果在4.1.1，4.1.2或4.1.3所列的标准，都没有得到满足。考虑尝试解决在表1中的因素。 分配50％的终点效价对于每块测定板，苏btract从所有读数的平均背景（无抗原加入孔）。 计算每个血清稀释度的抑制百分比用以下公式：100×（OD 病毒唯一的控制 – OD 测试样品 ）/ OD 病毒唯一的控制 。 确定导致最大信号的至少50％抑制的最高稀释度。 举报此稀释为50％终点效价的倒数。 注意：如果50％抑制完全没有任何稀释实现的，效价是低于测试的第一稀释， 例如 ，<10时1:10是测试的第一次稀释。 计算50％抑制浓度（IC 50） 使用四参数逻辑回归来确定IC 50滴度如下：减去所有读数的平均背景，然后将结果传送到执行回归分析的程序。 使用非线性回归，与最大设定该病毒仅控制和最小设置为零，以确定与恰好50％抑制对应的稀释度。 报告该稀释作为IC 50滴度的倒数。