효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

조류 구성 요소와 모든 살아있는 된 재조합 바이러스는 바이오 안전성 레벨을 미국 농무부 (USDA) 및 제도적 바이오 안전성위원회에 의해 사용이 승인 실험실 – 향상된 사례 2 (BSL2)를 사용하여 처리해야합니다. 시약 및 출발 물질의 제조 1 주 : 모든 시약의 소스를 획득하기 위해 상기 재료 표를 참조. Fetuin 코팅 된 플레이트 90 ml를 10 ml의 10 배 코팅 완충액을 혼합하여 코팅 버퍼를 준비하여 H 2 O를 탈 -20 ℃에서 500 μL 씩 도포에 1X 버퍼 저장에 25 ㎎ / ㎖의 fetuin의 스톡 용액을 제조 하였다. 1 배 코팅 버퍼를 1,000 배 원액을 희석하여 즉시 코팅 플레이트 전에 fetuin (25 μg의 / ㎖)의 작업 솔루션을 준비합니다. 알로 fetuin의 작동 용액 100 ㎕를 분배하는 멀티 채널 피펫을 사용하여높은 단백질 결합능을 갖는 96- 웰 플레이트의 웰 L. 다음 10의 그룹으로 판을 쌓아 호일을 감싸 접시 시일 각 플레이트를 커버. 분석법을 수행하기 전에 냉장고 (2-8 ° C)에 대한 최소 18 시간에서 접시를 놓습니다. 주 : 플레이트를 미리 도포하고, 최대 2 개월 동안 2-8 ℃에서 상기 코팅 용액으로 저장 될 수있다. 희석제 94.2 mL의 혼합 바이러스 샘플 희석액 (2- (N의 -morpholino) 에탄 설 폰산 (MES)의 pH 6.5, 20 mM의 CaCl2를 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 % 트윈 20)를 만들기 위해, 희석제를 제조 1X MES, 2 ml의 CaCl2를 (10 ㎎ / ㎖)으로 pH 6.5, 3.3 ml의 30 % BSA 및 0.5 ㎖의 트윈 20. 2ml의 CaCl2를 (10 ㎎ / ㎖)가 94.7 ㎖의 1X의 MES, pH가 6.5를 혼합, PNA-HRPO (MES, 20 mM의 CaCl2를하고 1 % BSA으로 pH 6.5)에 희석을 준비하고, 3.3 ml의 30 % BSA하려면 . 뉴 라미니다 아제 (NA) 참고 : H6Nx 바이러스 reass게시 된 방법 5,10 다음 ortants (이러한 H6 서브 타입의 HA와 관심의 NA가) 생성됩니다. 그들은 사내 사용할 수없는 경우 공동 작업자에서 불 활성화 된 재조합 바이러스의 튜브를 요청합니다. 불 활성화 된 바이러스를 사용하는 경우, 제제는 비활성화 프로세스 NA 활성에 큰 영향을 미치지 않았다 시범을 통해 엘라에 사용하기에 적합한 것으로 확인. 문화 발육 계란 11 H6Nx 바이러스의 재고 및 -80 ° C에서 깔끔한 뇨 유체의 0.5 ml의 분취 량을 저장합니다. 각 분석에 대한 바이러스의 새로운 나누어지는을 사용합니다. 동결 및 분취 액을 해동하지 마십시오. 혈청 샘플 및 컨트롤 모든 혈청 열 불 활성화 (시험 샘플을 예를 들면, 전후 접종 혈청뿐만 아니라 제어, 예를 들면, 공지 된 NI 역가 샘플) 45 ~ 60 분 동안 56 ℃에서 물 중탕한다. 전 또는 열처리 후 -20 내지 -70 ℃에서 혈청 보관. SAMP의 경우레 반복 시험 샘플 반복 냉동 융해되지 않도록 동결 전에 몇 분취 량을 확인하여야한다. 높은 역가와 적어도 낮은 역가와 다른 하나를 식별하는 (> 5 ㎖) 합리적인 수량에서 사용할 수있는 인간 혈청의 NI 역가를 측정 할 수 엘라를 사용합니다. 100 μL 씩 저장 ≤ 20 ° C 동일한 샘플 분석 성능을 추적하기 위해 많은 검정에서 대조군으로 사용할 수 있도록. 피넛 응집소 (PNA) – 서양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRPO) PNA-HRPO 희석제 (MES, CaCl2를 1 % BSA를 사용하여 pH 6.5)을 준비한다. 희석제를 1ml PNA-HRPO 1 mg을 용해하여 PNA-HRPO 스톡 용액을 제조 하였다. -20 ° C에서 20 ~ 200 μL 씩 보관하십시오. (양성 대조군으로 최대 OD 결과 양을 확인하려면이 시약의 2000 희석 (바이러스 만 해당) 및 배경 : 500, 1 : 750, 1 : 1,000 및 1 새로운 PNA-HRPO 많은 테스트 1을 사용하기 전에 더 바이러스) t 없습니다모자는 <인 긍정적 인 신호의 10 %. 2.1 절에 설명 된대로 사통 바이러스 희석합니다. 2.2 절에 설명 된대로 fetuin 코팅 된 플레이트에 희석을 전송하고 37 ° C에서 접시를 품어. 16 ~ 18 시간 후 접시를 씻으 1 추가 : 접시의 행을 복제 PNA-HRPO 2,000 희석 (100 μL / 웰) : 500, 1 : 750, 1 : 1,000 및 1. 2.3.9에 단계 2.3.4에 설명 된대로 분석을 완료합니다. > 10 배 배경입니다 최대 신호 결과 희석을 선택하기 위해 데이터를 검토합니다. 즉시 사용하기 전에, 1.5.3에서 확인 된 PNA-HRPO의 최적 희석을 준비합니다. 세척 완충액 (0.01 M 인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4의 0.05 % 트윈 20 (PBS-T))의 큰 볼륨을 준비한다. 실온에서 보관하십시오. 퍼 옥시다아제 기판 (오 – 페닐 렌 디아민 디 히드로 클로라이드 (OPD)를) 준비 : 참고 사항 : 3,3 같은 대체 퍼 옥시 다제 기질 '이용 될 수 있고, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 분석의 날에 100 ㎖ DH 2 O 1 캡슐을 용해하여 인산 구연산 버퍼를 준비합니다. 사용 직전 인산 구연산 완충액 20ml에 1 OPD 정제 (10 mg)을 녹인다. 정지 용액 (1 NH 2 SO 4)를 준비 : SO 4 973 ml의 DH 2 O.에 27.2 ml의 재고 98 %의 H 2를 추가 혼합 한 다음 실온에서 보관하십시오. NA의 양 2. 결정은 엘라에서 사용하는 96 웰 플레이트에 바이러스 희석 준비 열 희석 판의 1-11에 120 μL 샘플 희석제 (섹션 1.2) 분배. 열 1로, 추가로 96 μl의 샘플 희석제를 추가합니다. 해동 한 후이 바이러스시 10 분 희석을 제공 열 1의 우물을 복제하기 위해 24 μl를 추가하기 전에 바이러스의 병을 소용돌이. 전사함으로써, 샘플 희석제 바이러스의 연속 2 배 희석액을하나에서 잘 각각의 희석에 대한 다음 사용하여 깨끗한 피펫 팁 120 μL. Fetuin 코팅 된 플레이트에 바이러스 희석 이동 PBS-T (1.6 절)과 fetuin 코팅 된 플레이트 3 회 반복 한 후 초과 세척 버퍼를 제거하는 흡수 종이 타월에 각 판을시킨다. fetuin 코팅 된 플레이트 (11)에 열이 각 웰에 1 샘플 희석제 (섹션 1.2.1)의 50 μl를 추가합니다. 칼럼 12의 시료 희석액 100 ㎕를 (이 웰은 음성 대조군이다) 추가한다. 전송 컬럼 fetuin 코팅 된 판의 해당 우물에 희석 판의 1-11에서 희석 바이러스의 50 μL. 접시 실러와 함께 접시를 커버 한 다음 37 ℃에서 가습 인큐베이터에 넣습니다. 나머지 단계 (16 ~ 18 시간 이상)을 수행 할 것입니다되는 시간을 기록합니다. 개구 결정을 완료 배양이 (16-18 시간)이 완료되면, 전송벤치에 플레이트와 플레이트의 봉인을 제거합니다. PBS-T (1.7 절)과 판 6 회 반복 한 후 반전과 흡수성 종이 타월에 빈틈이 모든 액체가 우물에서 제거되었습니다 확인 할 수 있습니다. 모든 우물에 (1.5.3에서 결정된 희석) 100 μL / 잘 PNA-HRPO 솔루션을 추가하고 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어. 배양 끝까지 미만 15 분 전에 1.7 절에서 설명한 바와 같이, OPD 용액을 제조 하였다. PNA-HRPO를 제거하고 각 웰에 OPD 기판의 100 μl를 추가하기 전에 건조시킨다하기 위해 시험 플레이트를 3 회 반복한다. 실온에서 정확히 10 분 동안 접시를 품어. 100 μL / 1N 황산 웰을 첨가하여 반응을 정지. 0.1 초 동안 490 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 측정하는 플레이트 리더를 사용합니다. 저장 한 모든 데이터 파일을 내 보냅니다. 혈청학에 사용되는 바이러스 희석을 선택 외경, 420㎚을 나타내는 그래프 그리기 </sUB> 각각의 바이러스 희석 값. (이것은 일반적으로 적정 곡선의 시작 부분에서 평탄 역에 해당하는 신호), 최소 신호 (백그라운드 제어를 제공 판의 열 (12)에는 바이러스가없는 웰) 최대 신호를 식별하는 적정 곡선 점검 상기 입력 희석 (즉, 곡선의 선형 영역)에 비례 OD 결과 바이러스 희석액. 최대 신호의 약 90 %를 제공하고, 선형 범위 내에 바이러스 희석액을 선택한다. 선택한 희석에서 OD가 적어도 배경 신호보다 10 배 있는지 확인합니다. 이 특정 바이러스 주식을 사용하는 모든 분석을 위해 선택된 바이러스 희석을 사용합니다. , 또는 바이러스의 NA 활동을 측정하고 엘라에 15 ~ 20 ~ μU NA 활동 / ㎖를 사용합니다. 3. 렉틴 분석 효소 연결 참고 : 그림 2 웃음을희석 및 분석 판의 설정을 WS. 샘플 희석합니다 얼음에 열 불 활성화 샘플을 놓습니다. 참고 : 8 혈청 각 플레이트에 희석 될 수있다. A는 판에서 1:10부터 희석액을 사용하여 설정을 위해, 열 3-11의 모든 웰에 120 ㎕의 샘플 희석제를 추가합니다. 열 2, 샘플 희석액 216 ㎕를 각 샘플의 24 μl를 추가합니다. 최대 피펫 팅에 의해 3 번 아래로 잘 샘플을 혼합 한 후 다음 컬럼에 120 μl를 전송합니다. 피펫 팁을 변경 한 후, 아래로 피펫 팅에 의해 우물의 내용을 혼합 한 후 다음 컬럼에 120 μl를 전송합니다. 샘플까지 단계를 반복 3.1.4 열 (11)에 전송 된 나머지 120 μl를 폐기. Fetuin 코팅 된 플레이트에 샘플 및 바이러스 추가 바이러스, 소용돌이의 병을 해동하고 2 단계에서 선택한 희석 희석제 (1.2 절)에 바이러스를 재현 탁.4.2. 각 분석 플레이트에 대한 바이러스의 적어도 5 mL를 준비합니다. 플레이트를 세척 및 혈청 샘플 판에 추가 될 때까지 얼음에 희석 바이러스를 유지합니다. 분석에 필요한 fetuin-코팅 된 플레이트의 수 결정 (일반적으로 접시 당 4 개의 혈청을 적용). PBS-T로 fetuin 코팅 된 플레이트 3 회 반복 한 다음 각 플레이트를 반전 과잉 세척 버퍼를 제거하는 흡수 종이 타월 위에시킨다. 열 2-11 중복 우물에 희석 플레이트에서 각 혈청 제어 또는 샘플 희석 50 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 음성 대조군 (열 12)을 제외한 모든 웰에 희석 바이러스의 50 μl를 추가합니다. 1 열에서 우물에 샘플 희석제 50 μl를 추가하고 열 (12)에 샘플 희석제 100 μl를 추가합니다. 접시 실러와 함께 우물을 덮고 부드럽게 플레이트의 측면을 누르거나 10 초 동안 보통 속도로 접시 통에 넣어 혼합한다. humidif에 접시를 놓고16 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 IED 인큐베이터. PNA-HRPO을 추가하고 2.3 절에 설명 된대로 분석을 완료 4. 데이터 분석 상기 분석 결과의 유효성을 확인합니다 배경 값 (더 바이러스) 양성 대조군 (바이러스없이 혈청)의 10 % 미만임을 확인합니다. 동일한 조건을 사용하여 다른 분석에서 제어 혈청 실행의 역가가 평균 역가의 2 배 내에 있는지 확인합니다. 제어 우물의 OD 측정은 (≤20 % 다른) 일치 및 중복 샘플 우물의 OD 측정은 (≤10 % 다른) 일관성을 확인합니다. 잘못된 결과의 근본 원인을 확인하고 4.1.1, 4.1.2 또는 4.1.3에 나와있는 조건이 충족되지 않으면 분석을 반복합니다. 문제를 해결하려고 할 때 표 1에 제시된 요인을 고려하십시오. 50 % 종점 역가 할당 각 분석 플레이트, 스와의 경우모든 측정 값의 평균 배경 (웰에 첨가없이 항원) btract. 수식을 이용하여 각각의 혈청 희석의 억제율을 계산한다 : 100 × (OD 바이러스 전용 제어 – OD 시험 샘플) / OD 바이러스만을 제어한다. 최대 신호의 적어도 50 % 억제를 초래 최고 희석액을 식별한다. 50 % 엔드 포인트 역가 등이 희석의 역수를보고합니다. 참고 : 50 % 억제가있는 희석 달성되지 않은 경우, 역가 시험 제 희석 미만인 예, <10 1:10 시험 제 희석한다. 50 % 억제 농도를 계산 (IC 50) 회귀 분석을 수행하는 프로그램에 결과를 전송하는 모든 수치의 평균 배경을 빼고 다음과 같이 IC (50) 역가를 결정하는 네 가지 파라미터 로지스틱 회귀 분석을 사용한다. 최대 집합, 비선형 회귀를 사용하여바이러스만을 제어하고 정확히 최소 50 % 억제에 해당하는 희석을 결정하기 위해 0으로 설정. 이 IC (50) 역가 등이 희석의 역수를보고합니다.