生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

注：メタボリック・プロファイリング研究のためのsheathless CE-MSを使用するためにここで説明するプロトコルは、実験室での使用のみのためです。以下に概説する手順は、最近公表された研究4,5に基づいています。さらなる実験の詳細は、これらの論文に記載されています。このプロトコルを使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで概説した実験を行う場合、安全メガネ、白衣と手袋を含め、すべての適切な実験室の安全手順を使用してください。 試薬溶液および試料の調製 バックグラウンド電解質の調製（BGE） 毎日新しいBGE溶液（10％（v / v）の酢酸、pHが2.2）を準備。 10mlのガラスバイアル中への水の9.0ミリリットルを追加し、ドラフト内で水に酢酸1.0ミリリットルを追加します。ボルテックスを用いて溶液を十分に混合します。 代謝物のstandarの調製Dの混合物 50μlの水に60陽イオン性代謝物を含む50μMのカチオン標準混合物の50μLを溶解し、溶液を十分に混合します。 -80°Cで保存したときに使用されていません。 50μlの水に30アニオン性代謝産物を含む50μMアニオン標準混合物の50μLを溶解し、溶液を十分に混合します。使用しないときは-80℃で、同じ標準混合物の凍結/融解サイクルを防止するために、一定分量で、このソリューションを保管してください。 注：-80℃で適切に保存した場合の代謝産物標準の混合物は、3ヶ月間安定です。 神経膠芽腫細胞株からの抽出物の調製 1 mlの氷冷0.9％塩化ナトリウム溶液21を付着ヒトU-87 MG神経膠芽腫細胞を3回洗浄します。 接着細胞を（V / V 8/2）2 mlの氷冷メタノール/水の溶液を加え、ゴム先端セルスクレーパー21を用いてこすり。 </l私> 2分間のメタノール/水チューブ内の溶液とultrasonicateを収集します。 16,100×gで、4℃で10分間、メタノール/水画分（最終比8/8/2、v / v / v）で遠心分離機にサンプルをクロロホルムを加えます。 メタノール/水層を回収し、真空濃縮器を使用して、この画分を蒸発させます。 sheathless CE-MSによる分析のために50μlの水に乾燥した材料を再構成します。使用時に-80℃でサンプルを保管しません。 2. Sheathless CE-MSシステムの設定 多孔質の先端エミッタとの裸の溶融シリカカートリッジの取り付け CE機器に（90センチメートル総縦x内径30μm）の多孔質先端エミッタと新しい裸の溶融シリカカートリッジを置きます。 ソフトウェアは100％メタノールを使用してCE機器を制御して15分間50psiで前方にリンスを適用し、視覚的に液体がcapilから流出しているかどうかを確認このすすぎ工程の間ラリアウトレット。また、視覚的に液体が導電性毛細管から流出されているかどうかを調べるにBGE液を用いて5分間50psiで反対方向にリンスを行います。 いかなる液滴形成はキャピラリー出口で観察されなかった場合には100psiの圧力で繰り返しステップ2.1.2。何の液滴の形成は、このステップの間に観察されなかった場合は、新しい裸の溶融シリカカートリッジを取り付けます。 10分間、50psiで10分間、50psiで、次いで水、10分間50psiで0.1 MのNaOH、続いて10分間、50 psiで、で水と分離キャピラリーを洗浄し、最後にBGE有します。 注：2.1.4まで2.1.1が唯一の新しいキャピラリーカートリッジのインストールに必要な手順。 ESI-MSへの毛細血管多孔質先端エミッタのカップリング 注：MSへのCEキャピラリーを結合する前に、MS機器を校正およびCEシステムに接続されていることを確認してください。へのESI電圧を設定します。0ナノスプレー源を持つMS機器を取り付けます。ガス1、ガス2およびインターフェースヒーター温度はわずか5 psiで1500 V.セットカーテンに設定し、イオンスプレー電圧を印加することによって発生する非常に低い流速でESIとして適用されませんでした。 水管から溶融シリカカートリッジの噴霧器の先端を取り外し、MS機器に結合するためのナノスプレーソースアダプタに取り付けます。 CE機器におけるBGEバイアルの高さは、噴霧器先端部の高さと一致していることを確認してください。 5分間50psiでBGEですすぐことにより、導電性毛細血管を通る液体の流れを確認してください。このすすぎ工程の間、ESIスプレー針のベースのドロップ形成が観察されるはずです。 順方向に10分間50psiでBGEと分離キャピラリーをフラッシュします。ドロップの形成は、このステップの間に多孔質先端エミッタ（噴霧器の先端部）の先端に観察されるはずです。 位置Cの距離でMS入口の入口に多孔質先端エミッタIRCA 2ミリメートル3。 1分のランプ時間を使用して、30キロボルトの電圧を印加し、第0のESI電圧を使用して、メタボリック・プロファイリング研究のために65〜1000 のm / zへのm / z範囲内のMSデータの取得を開始。 メモ：エレクトロスプレーがあってはならないとして、質量スペクトルは、信号の無効にする必要があります。 データの測定に運ぶながら千VにESI電圧を設定します。一定の背景信号まで、200 Vの増分でESI電圧を増加させるには、少なくとも15分間観察されます。 最大かつ最も安定なMS信号（総イオン電気泳動）を提供する位置を参照するために、X、Y、またはZ軸方向に移動させることにより、MSの注入口の中心に対して多孔質先端エミッタ位置を最適化します。 多孔質先端エミッタの位置を最適化し、最適なESI電圧を決定した後、0VにESI電圧を設定し、5分のランプ時間を用いて、1キロボルト30キロボルトからCEの電圧を低下させます。 MS法のusinを作成します。グラム最適なESI電圧および代謝物の基準および生物学的サンプルの分析のためのCE機器にCE法。 代謝物標準と生物学的サンプルの3解析 sheathless CE-MSシステムの性能評価 CEバイアルに適合し、入口サンプルトレイにこのバイアルを入れて空を100μlマイクロバイアル（PCRバイアル）に転送アニオン性代謝物の標準的な混合物を20μl。 注：信頼性の注入のためのマイクロバイアルに必要な最小量は2μlです。 ステップ2.2.9中に作成されたMSの買収負イオンモード法を開始し、その後、CE機器を制御するソフトウェアを使用して、CEシーケンスを開始します。 10 1.0 psiでBGE注入によって、その後60秒間2.0 psiで注射を3分間50psiでBGEと分離キャピラリーをすすぐ（NL 20は、毛細管容積の3％に相当する）と、秒。 注：その後、MSデータ取得がトリガされます。 入口で30分間、0.5 psiの圧力で1.0分のランプ時間との-30 kVの電圧を適用します。 30分電気泳動分離後、MSデータ収集を停止し（電気泳動分離は、多孔質先端キャピラリエミッタの耐久性を向上させた後にCE電圧の漸減）5分のランプ時間を使用すること-1キロボルトCE電圧を低下させます。 試料注射の間、3分間、30psiで水によるキャピラリー、0.1 M水酸化ナトリウム、水およびBGE各リンス。 移動時間と分析アニオン性代謝産物混合物の信号強度を決定することによって記録されたデータを分析します。 陰イオン性代謝物質の基準は10と28分の間の領域に表示されるかどうかを評価します。 3構造的に関連の異性体、 すなわち 、D-グルコース-1-リン酸、D-グルコース-6-リン酸とD-フルクトース-6-リン酸があるかどうかを確認してください部分的に分離、 すなわち 、最初の2つのピークの間の分解能は0.75年頃、最後の2つのピークのである（ 図1を参照）0.50年頃です。 注：1.5の解像度は、2つの隣接するピークのベースライン分離を示しています。 繰り返しは、カチオン性代謝物の混合物のために3.1.1と3.1.2を繰り返します。 MS検出は、陽イオンモードになりましたし、CE電圧は30 kVであることを確認してください。 移動時間と分析カチオン性代謝産物混合物の信号強度を決定することによって記録されたデータを分析します。 カチオン性代謝物の規格は8と22分の間の領域に表示されるかどうかを評価します。イソロイシンとロイシンが15〜15.5分を移行するかどうかを確認し、解像度は0.5年頃であるかどうかを判断。 生物学的サンプルの分析 繰り返しは、神経膠芽腫細胞株の抽出物の陰イオン性代謝プロファイリングのために3.1.1と3.1.2を繰り返します。 注：代謝コン試料の前処理後に得られた10トン、20細胞/ NL年頃の細胞密度に対応し、したがって、20 nlの注入は、分析あたり400セルの等価です。 。 5 MDA質量精度を使用して、代謝産物の乳酸（ のm / z 89.0243）のための抽出イオン電気泳動を作成し、信号強度が100,000カウントを超えているかどうかを確認してください。 繰り返しは、神経膠芽腫細胞株の抽出物のカチオン性代謝プロファイリングのために3.1.1と3.1.2を繰り返します。 注：高度情報豊富な全イオン電気泳動図は、このモードでは、20 nlの注入のために観察されるはずです。 分析または使用しないときにした後、15分間50psiで水でキャピラリーを洗浄し、また、水を含むチューブに水と多孔質部（出口部分）を含むバイアル中のキャピラリーの入口部分を格納します。