Détection de l'activité dépendant du pH de<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> In vitro</em> et<em> In Vivo</em

Un environnement naturel commun dans lequel les agents pathogènes microbiens expérience protéines conditions qui se déroulent à l' acide induite est l'estomac des mammifères (plage de pH 1-4), dont le pH acide sert une barrière efficace contre les agents pathogènes d'origine alimentaire ^1. Dépliement des protéines et de l' agrégation, qui est causée par la protonation de la chaîne latérale d'acides aminés, affectent les processus biologiques, endommage les structures cellulaires et provoque finalement la mort cellulaire ^1,2. Etant donné que le pH du périplasme bactérien s'équilibre presque instantanément le pH de l' environnement due à la diffusion libre des protons à travers la membrane externe poreuse, les protéines de la membrane périplasmique et internes des bactéries Gram-négatives sont des composants cellulaires les plus vulnérables dans des conditions acides au stress ^3. Pour protéger leur protéome périplasmique contre les dommages induits par l'acide rapide, les bactéries Gram-négatives utilisent les chaperons périplasmiques activés par un acide et HdeA HdeB. HdeA est un chaperon conditionnellement désordonné <sup> 4,5: A pH neutre, HdeA est présente sous forme repliée, dimère de chaperon inactif. Après un changement de pH inférieur à pH 3, la fonction de chaperon de HdeA est rapidement activé ^6,7. L' activation de HdeA nécessite de profonds changements structurels, y compris sa dissociation en monomères, et le dépliement partiel des monomères ^6-8. Une fois activé, HdeA se lie aux protéines qui se déroulent dans des conditions acides. Il empêche efficacement leur agrégation à la fois au cours de l'incubation à faible pH, ainsi que sur la neutralisation du pH. Lors du retour à pH 7,0, HdeA facilite le repliement de ses protéines clientes de manière ATP-indépendante et reconvertit en son dimère, conformation chaperonner-inactive ^9. De même, le chaperon HdeB homologue est également chaperon inactif à un pH de 7,0. Contrairement à HdeA, cependant, l'activité de chaperon de HdeB atteint son maximum apparent à pH 4,0, les conditions dans lesquelles HdeB est encore largement plié et dimères ^10. De plus, abaissant encore les caus de pHes l'inactivation de HdeB. Ces résultats suggèrent que, malgré leur grande homologie, HdeA et HdeB diffèrent dans leur mode d'activation fonctionnelle qui leur permet de couvrir une large gamme de pH avec leur fonction protectrice de chaperon. Une autre protéine chaperon qui a été impliquée dans la résistance à l' acide de E. coli est la Hsp31 cytoplasmique, qui semble stabiliser les protéines clientes dépliés jusqu'à des conditions neutres soient rétablies. Le mode précis de l'action de Hsp31, cependant, est resté énigmatique ^12. Étant donné que d' autres bactéries entéropathogènes telles que Salmonella manquent l'opéron hdeAB, il est très probable que d' autres chaperons périplasmiques non encore identifiés pourraient existent qui sont impliqués dans la résistance aux acides de ces bactéries ^11.

Les protocoles présentés ici permettent de surveiller l'activité de chaperon dépendant du pH HdeB in vitro et in vivo , ¹⁰ et peuvent être appliqués pour étudier d' autres chaperonstelles que Hsp31. En variante, le réseau complexe de facteurs de transcription qui contrôlent l'expression des hdeAB peut potentiellement être étudiée par le test in vivo du stress. Afin de caractériser la fonction de chaperon de protéines in vivo, les différentes configurations expérimentales peuvent être appliquées. Une voie est d'appliquer la protéine dépliage des conditions de stress et de caractériser les souches mutantes phénotypique que soit surexpriment le gène d'intérêt ou de porter une délétion du gène. Des études protéomiques peuvent être menées pour identifier les protéines qui ne sont plus globale dans des conditions de stress lorsque le chaperon est présent, ou l'influence d'un chaperon sur une enzyme spécifique peut être déterminée dans des conditions de stress à l' aide de dosages enzymatiques ^14-16. Dans cette étude, nous avons choisi de surexprimer HdeB dans une souche rpoH de suppression, qui n'a pas le choc thermique facteur sigma 32. rpoH contrôle l'expression de tous les principaux E. chaperons coli et sa suppression est connu pour augmenter sensibilité à des conditions de stress environnementaux qui causent le dépliement des protéines ^15. L'activité in vivo dans le chaperon de HdeB a été déterminée en surveillant sa capacité à supprimer la sensibilité au pH de la souche Δ rpoH. Au total, les protocoles présentés ici fournissent une méthode rapide et simple pour caractériser l'activité d'un chaperon activé par un acide in vitro ainsi que dans le contexte in vivo.