Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
D'ailleurs le génome nucléaire, chaque cellule eucaryote contient également des milliers de copies de petits ADN circulaires dans la matrice mitochondriale. Alors que l'ADN mitochondrial (ADNmt) codant pour les sous-unités essentielles de la chaîne de transport d'électrons, la majeure partie du protéome mitochondrial, y compris les facteurs de transcription et la réplication de l'ADN mitochondrial sont codées par le génome nucléaire. Par contraste avec le génome nucléaire qui suit les lois de Mendel de l'hérédité, le génome mitochondrial des animaux est héritée exclusivement par la lignée maternelle. Par conséquent, comprendre comment l'ADNmt est proliféré et transmis d'une génération à l'autre par l'ovocyte femelle est fondamentalement important. Cependant, le débat se poursuit sur la façon dont la réplication ADNmt est réglementée dans la lignée germinale femelle. En outre, la théorie de goulot d'étranglement ADNmt largement acceptée pour la transmission ADNmt suggère que la population de l'ADNmt dans les cellules germinales primordiales est sous-échantillonné à un nombre relativement faible during développement 1 2. Elle implique également que la réplication de l'ADNmt est temporellement et spatialement réglementé durant l'ovogenèse. Par conséquent, la détection in situ de la réplication de l' ADNmt au cours du développement de la lignée germinale facilitera la compréhension du mécanisme de l' ADNmt héritage.
Drosophila oogenesis fournit un système génétiquement traitable pour étudier la réplication de l' ADNmt et la transmission. Dans chacun des deux ovaires chez la drosophile, il existe des chaînes 16-20 indépendantes des chambres d'oeuf appelées ovariole 3, qui sont les unités fonctionnelles de la production d'oeufs (voir figure 1A). Chaque ovariole contient une organisation linéaire progressive de l'ovogenèse, où l'extrémité antérieure est composée d'une structure appelée germarium. Le germarium est divisé en quatre régions qui contiennent des cellules germinales à des stades de développement distincts. Dans la région 1, les cellules souches germinales passent par la division asymétrique pour produire des cellules filles appelées cystoblasts. Région 2a contient les cystoblasts qui ont terminé leur division finale. Cystoblasts subissent quatre tours de groupes 16 cellulaires division production. Les cellules 16 restent reliées les unes aux autres par des ponts cytoplasmiques appelés canaux annulaires. Une seule des cellules engage la différenciation comme l'ovocyte, tandis que l'autre 15 se développent en tant que cellules nourricières polyploïdes. Une structure essentielle cytoplasmique dite fusome, il est proposé de faciliter avec la formation de canaux annulaires, déterminer la polarité du kyste et l'infirmière des interactions cellule-4,5 ovocyte. Comme les kystes se déplacent vers la région 2b, les structures de kyste couvrent toute la largeur de la germarium, et deviennent plus associés à des cellules folliculaires. Les structures de germarium se terminent par la région 3 contenant la première chambre d'œuf herbe. Par la suite, les chambres d'œufs sont assemblés à l'extrémité postérieure de la germarium, qui progressent à travers les ovariole en 14 étapes morphologiquement distinctes. La croissance de l'ovocyte dépend des cellules nourricières, whprotéines de transport ich, ARNm et structures endomembranaires (par exemple, Golgi) via les canaux périphériques dans l'ovocyte. Au cours de la drosophile ovogenèse, il a été constaté qu'une fraction des mitochondries dans chaque kyste 16 cellules ont été associés à l'fusome, déplacé à travers les canaux périphériques et ont été livrés dans le seul ovocyte dans une grande masse appelée Balbiani corps 6. Ce phénomène a été proposé de contribuer au contrôle de la qualité de transmission mitochondriale par les ovaires des femmes.
La détection de la synthèse de l'ADN mitochondrial repose sur l'incorporation de précurseurs d'ADN marqués dans l'ADN cellulaire. Traditionnellement, un analogue nucléosidique de la thymidine 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) a été utilisé pour marquer la réplication de l' ADN mitochondrial dans des cellules de culture tissulaire à 7,8. Cependant, le marquage BrdU à base d'anticorps présente plusieurs limites, en particulier pour l'ensemble du montage coloration des tissus. Un inconvénient majeur de marquage BrdU est qu'il nécessite dénaturation de l'ADN pour exposerl'épitope BrdU, de sorte qu'il puisse être détecté par l'anticorps anti-BrdU. L'échantillon doit être traité dans des conditions de dénaturation difficiles tels que les produits chimiques (par exemple, l' acide chlorhydrique ou des mélanges de méthanol et d' acide acétique), la chaleur ou la digestion par DNase, ce qui pourrait perturber la structure de l'échantillon et de compliquer la procédure de coloration suivante 9, 10.
Ici, une variante analogue de la thymidine 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (UED) est utilisé pour marquer l'ADN mitochondrial de Drosophila se répliquer dans les ovaires adultes. Cette méthode est plus rapide et hautement sensible. EdU est facilement incorporé dans l'ADN cellulaire lors de la réplication de l'ADN. La détection suivante est basée sur une réaction «clic», un Cu (I) catalysée réaction covalente entre le groupe alcyne terminal et un azoture fluorescent 10. Étant donné que la réaction ne nécessite pas la dénaturation de l'échantillon, il permet une bonne conservation structurelle. En outre, la taille du colorant d'unZide est seulement 1/500 de celle d'une molécule d'anticorps 10, ce qui permet une pénétration rapide et efficace des tissus entiers de montage. Nous avons utilisé cette méthode pour détecter la réplication de l' ADNmt pendant Drosophila ovogenèse et a trouvé un modèle spatial de frappe dans la région germarium de Drosophila ovaire 11, ce qui nous conduit à proposer un ADNmt mécanisme d'héritage sélectif de réplication dépendante. Nous présentons ici un protocole détaillé sur l' étiquetage EdU de réplication ADNmt dans les ovaires chez la drosophile. Pour démontrer l'application du protocole, nous avons également testé la réplication de l' ADNmt dans un ADNmt mutant Drosophila (mt: CoI T300I) 11, ainsi qu'avec le traitement diversifié de découpleurs mitochondriales, qui dissipent la membrane mitochondriale potentiel et potentiellement perturber la réplication de l' ADNmt.
l'étiquetage EdU est une méthode nouvelle et efficace pour détecter la synthèse d'ADN dans des cellules proliférantes, qui est basée sur l'incorporation et la coloration des analogues de nucléoside dans l'ADN nouvellement synthétisé. Cette méthode est supérieure à la méthode de marquage BrdU en ce qu 'elle est plus rapide et hautement sensible. Plus important encore , il permet une bonne conservation structurelle et efficace pénétration EdU-colorant de l' ensemble du montage des tissus 9, 10. Historiquement, comme une alternative supérieure à l' étiquetage de BrdU, l' étiquetage EdU a été utilisé pour l' étude de la réplication de l' ADN nucléaire au cours de la phase S du cycle cellulaire. Aphidicoline est un inhibiteur de l' ADN polymérase α, qui est la principale polymerase pour la replication de l' ADN nucléaire de la phase S 12 15. la réplication de l'ADN mitochondrial est effectuée par γ de la polymérase d'ADN, ce qui est insensible au traitement aphidicoline. Par conséquent, le traitement à l'aphidicoline avant et pendant l'incubation EdU a inhibé de manière significative EdU incorporation dans l'ADN nucléaire. Cela devraitnoter que aphidicoline peut être stable pendant plusieurs semaines si stocké de manière appropriée, et l'efficacité de l'aphidicoline dans l'inhibition de la réplication de l'ADN nucléaire était variable dans nos mains. Les ovarioles ou chambres d'oeufs avec un fort marquage de l'ADN nucléaire devraient être exclus de l'analyse d'autres données.
la réplication de l'ADN mitochondrial peut être facilement visualisé comme puncta dans le cytoplasme, qui offre aussi un moyen simple de quantifier le niveau de réplication ADNmt en comptant le nombre de EdU puncta, normalisé au volume total du cytoplasme. Logiciel d'imagerie peut être utilisé pour identifier automatiquement EdU lacrymaux dans des images microscopiques, ce qui est particulièrement utile pour des analyses informatiques de grands ensembles de données. Cependant, des précautions doivent être prises, car l'inhibition incomplète de la réplication de l'ADN nucléaire peut conduire à l'incorporation dans EdU loci distincts sur le chromosome et afficher comme puncta l'intérieur du noyau. Aussi dans d'autres cas, l'intensité de l'incorporation dans EdU repliCating ADNmt pourrait être faible, alors que le fond et le bruit pourrait être élevé. Par conséquent, les paramètres individuels pour les analyses d'image automatiques doivent être soigneusement définis. Il est également recommandé que les images doivent être examinées avec les yeux formés pour vous assurer que puncta appropriée EdU sont identifiés.
Visualisation de l' ADNmt nouvellement synthétisé au cours de la drosophile oogenesis donne l'occasion d'examiner comment la réplication de l' ADNmt est régulée dans des conditions physiologiques ou pathologiques, en réalisant l'expérience dans les mouches soumises à une variété de perturbations pharmacologiques ou génétiques. Dans une étude précédente, EdU dosage d'incorporation a été réalisée dans un ADNmt mutant Drosophila mt: CoI T300I 11. Par ailleurs, afin de perturber le potentiel de la membrane mitochondriale, les ovaires ont été traitées avec diverses concentrations de FCCP découpleur mitochondrial ou le 2,4-dinitrophénol (DNP) avant l'incorporation EdU. En fonction des fins expérimentaleset les caractéristiques des médicaments, différentes méthodes peuvent être adoptées pour la livraison effective. Pour les mouches adultes, les médicaments peuvent se présenter sous forme de vapeur (par exemple, l' éthanol et la cocaïne) 16,17 ou des médicaments peuvent être injectés dans l'abdomen, où elle se diffuse rapidement à travers le corps 18. La pratique la plus courante est que les médicaments sont ajoutés à l'aliment de mouche ou un / papier filtre de drogue-saturée de saccharose. Par exemple, l'inhibiteur de l' assemblage des microtubules, la colchicine, a été introduit dans les mouches pendant 2-3 jours avant la dissection de l' ovaire 19. Par conséquent, il est important d'évaluer la méthode de distribution de médicaments et de choisir des concentrations appropriées.
Pour assurer la réussite de l' imagerie réplication ADNmt dans les ovaires chez la drosophile, plusieurs étapes critiques doivent être soigneusement exécutées. Tout d'abord, la préservation de la viabilité et de la santé des ovaires lors de la dissection et EdU incorporation est essentielle (étapes 1 et 2). Le milieu Drosophila de Schneider avec FBS doit être réchauffé à la température ambianteAvant utilisation. Il faut réduire au minimum le contact direct entre les chambres d'œufs et d'outils de dissection ou des embouts de pipette. Les ovaires doivent être immergés dans des solutions tout temps pour éviter la déshydratation. Une mauvaise manipulation des tissus peuvent facilement conduire à faible ou pas de signaux fluorescents. Lors de l'étape de montage de tissu, ovariole doivent être séparés les uns des autres et répartis sur la lame de microscope. Assurez-vous que les chambres d'oeufs ne sont pas empilées les unes sur les autres. Nous avons remarqué que les chambres d'œufs au-delà de l'étape 14 affichés peu incorporation EdU. En outre, en raison de la grande taille, la fin des chambres d'œufs de scène provoquent souvent les chambres d'œufs plus jeunes voisins d'être de mise au point. Ainsi, il est recommandé que les chambres de fin d'œufs de stade être jetés.
Ici , nous fournissons un protocole détaillé pour l' étiquetage répliquer ADNmt dans Drosophila ovaires adultes. Cette méthode permet de quantification simple de réplication ADNmt sous diverses perturbations génétiques et pharmacologiques,et sera utile pour les mécanismes sous-jacents biogenèse mitochondriale du développement et de l'ADNmt héritage de dissection.
The authors have nothing to disclose.
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
FCCP | Sigma | C2920 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |