Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em> Escherichia coli</em>: Ontwerp, Productie en zuivering

Hier gepresenteerd is een methode voor het ontwerp, de productie en zuivering van enzym geladen bacteriële buitenste membraan blaasjes (OMV). OMV zijn klein, vooral unilamellaire, proteoliposomen die variëren in grootte 30-200 nm ^1,2. Alle Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën die zijn tot nu toe onderzochte aangetoond loslaten van OMV of extracellulaire blaasjes (EV) vanaf hun oppervlak ^3,4. Het precieze mechanisme waardoor OMV geproduceerd nog niet volledig opgehelderd door de diverse bacteriële populaties die hen evenals de variërende functies die zij dienen afscheiden. OMV is aangetoond dat een breed scala van vracht van kleine moleculen, peptiden en proteïnen genetisch materiaal waar een verscheidenheid aan complexe signaal, gen translocatie en virulentie functies ^5,6.

De exacte mechanismen van OMV biogenese zijn niet goed gekarakteriseerd, en lijken te verschillen tussen bacteriesoorten. ondanks this feite hebben wij een werkwijze voor het verbeteren van de verpakkingsefficiëntie van een recombinant eiwit in OMV door een synthetische binding tussen een eiwit van interesse en een zeer overvloedige eiwit endogeen voor de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV ontwikkeld. Aangezien een synthetische verbinding of kunstmatig opgenomen affiniteit tussen het recombinant tot expressie gebrachte eiwit en het OMV de waargenomen verpakkingsefficiëntie zeer laag ^7. Dit resultaat is als incorporatie van de eiwitten in de OMV hetzij gebeurt door toeval inkapseling precies op het moment van OMV formatie op het bacteriële oppervlak of via gerichte verpakkingen met mechanismen die niet goed begrepen worden verwacht. Enig succes is waargenomen bij het verpakken eiwitten eenvoudig door overexpressie in de periplasmatische ruimte die berust op toeval inkapseling maar effectieve verpakking is sterk afhankelijk eiwit met sommige eiwitten verpakking hoog rendement in vergelijking met andere ebij niet verpakken helemaal ^8-10. Door gebruik gemeenschappelijke synthetische biologische technieken zochten we Escherichia coli (E. coli) gelijktijdig produceren, verpakken en uitscheiden een actief enzym plaats in OMV dat beperkingen huidige kennis over hoe OMV gevormd en hoe lading wordt geselecteerd door de bacteriën omzeilt ingenieur verpakking.

Voor de toepassing van deze applicatie is een split-eiwit bioconjugatie systeem gekozen als de synthetische verbinding van de keuze om gerichte verpakkingen in het OMV vergemakkelijken. Zoals de naam suggereert een split eiwit bioconjugatie systeem bestaat uit twee complementaire domeinen subeenheid die interageren met elkaar. De splitsing eiwitdomeinen geselecteerd voor de toepassing van dit protocol worden aangeduid als de SpyCatcher (SC) en SpyTag (ST) domein en zijn afgeleid van de Streptococcus pyogenes-fibronectine bindend eiwit (FbaB) ^11. Deze splitsing proteïnesysteem is ongebruikelijk doordat wanneer de twee subeenheden in de nabijheid een isopeptidebinding spontaan vormt tussen het proximale asparaginezuur en lysine aminozuurresiduen waardoor een covalente binding. Vorming isopeptidebinding niet de toevoeging van chaperone eiwitten, katalytische enzymen of cofactoren, en kan gemakkelijk plaatsvinden bij kamertemperatuur (KT) en over een groot aantal fysiologisch relevante omstandigheden ^12.

Als een proof of concept, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) van Brevundimonas diminuta werd geselecteerd om te worden verpakt in E. coli afkomstig OMV ^13. PTE bevat een binucleair Zn / Zn actieve plaats en heeft de mogelijkheid organofosfaten afbreken door een hydrolysereactie omzetten aryldialkylphosphates in dialkylphosphates en arylalcoholen ^14. Blootstelling aan organofosfaten schaadt juiste neurotransmitter functie door middel van het remmen van de hydrolyse van acetylcholine door acetylcholinesterase bij neuromusculaire verbindingen making organofosfaat afgeleide verbindingen uiterst gevaarlijk ^15. Langdurige of significante blootstelling aan organofosfaten vaak resulteert in oncontroleerbare stuiptrekkingen en meestal de dood veroorzaakt via stikken. Hoewel PTE vertoont de hoogste katalytische activiteit ten opzichte paraoxon, een zeer krachtige insecticide, maar ook kan hydrolyseren van een hele reeks andere pesticiden en V / G soort chemische zenuwgassen ^16. Om OMV verpakking te vergemakkelijken, werd een bacterieel plasmide geconstrueerd dat codeert voor een genconstruct dat een induceerbare promoter, een periplasmatische lokalisatiesequentie en een korte meervoudige kloneringsplaats stroomopwaarts van de SC gensequentie bevat. Insertie van het PTE-gen tussen de leider en SC-sequentie toegestaan ​​voor de oprichting van een genetische schakelaar die de PTE-SC fusie-eiwit richt naar de periplasmatische ruimte voor OMV verpakking. Hoewel de hier beschreven inspannen PTE, het enzym gen uitwisselbaar en kan gemakkelijk worden vervangen door een ander gensequentie FACilitate verpakking van een alternatieve enzym of eiwit.

Het tweede deel van de synthetische verbinding, is een overvloedig buitenmembraan eiwit (OmpA) gekozen om de ST peptidesequentie presenteren. Terwijl de keuze van anker-eiwit kan variëren, is het essentieel dat het eiwit een permissieve domein dat weer in de periplasmatische ruimte, tolereert de fusieconstruct zonder induceren cytotoxiciteit, bekend aanwezig OMV te zijn, en niet aggregeert als het recombinant geproduceerd. OmpA- is een 37,2 kDa transmembraan porine-eiwit dat bekend is in hoge mate tot expressie gebracht in de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV ^17. Het is betrokken bij het transport van kleine moleculen, <2 nm in grootte, in het bacteriële membraan ^18. Inheemse OmpA- twee structureel unieke domeinen, een transmembraan motief beta vat en een periplasmically oplosbare C-terminale deel gekende bindingspartners met peptidoglycan ^19. In de mutant OmpA-ST fusie designed hier het C-terminale gedeelte van OmpA werd verwijderd en de ST werd gefuseerd met de periplasmically gerichte N- of C-termini. De periplasmatische gedeelte van OmpA verwijderen vermindert het aantal interacties tussen het buitenste membraan en peptidoglycan waardoor membraan destabilisatie leiden tot hyper-blaasjes ^7. Genomisch OmpA- werd gehandhaafd evenals de recombinant tot expressie gebrachte OmpA-ST construct grove membraan destabilisatie beperken.