Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon

anlatılan tüm in vivo çalışma Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık Fat Pad Tahliller için 1. Örnek Hazırlıklar İzolasyon ve Kültür İlköğretim Tubal Epitel (TE) Hücreler CO 8 haftalık bakire β-aktin-Geliştirilmiş Yeşil floresan proteini (EFGP) ya da β-aktin-Discosoma Kırmızı Floresan Protein (DsRed) farelere servikal dislokasyon tarafından takip 2 yönetimini verici 6- euthanize. Bir ayak tutam başarılı ötenazi doğrulayın. emici drape, ventral yüzü up bireysel fare yerleştirin ve sonra% 70 etanol ile karın silin. vücut orta hatta lateral kesi yaparak ve parmak uçları üzerinde ve fare baş ve kuyruk doğru kesi altında cilt çekme ile cilt açın. Künt forseps kullanarak periton tutun ve vücut boşluğu açmak için ince makas ile kesim yapmak. Yavaşça intestin bobini itmekKenara e ve üreme organları bulun. ince forseps ile bir uterin boynuz pick up ve rahim boynuzları ayrı noktasının üstünde 0,5 cm kesti. uterin boynuz tutarken, bağ uterin boynuz bağlı doku, rahim tüp, yumurtalık ve yumurtalık yağ yastığı uzak teşrih. 6 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanak içinde parçalara üreme yolu yerleştirin. İkinci üreme sistemi ile devam edin. Bir Biyogüvenlik kabine çanak aktarın ve steril PBS 6 ml dokular 3 kere yıkayın. Biyogüvenlik kabinede yer alan bir diseksiyon mikroskobu altında çalışmaya devam. ince cımbız ile uterin boynuz tut ve utero-tubal kavşakta kesilmesinin uterin tüp uterin boynuz ayırın. 25 G iğne kullanılarak yumurtalık çevreleyen yumurtalık bursa kesin. Not: Yumurtalık bursa çıkarıldıktan sonra, diseksiyon tamamlandıktan ve bireysel uterus borusu PBS çözeltisi kalır. Bir Singl aktarın3,5 cm tabak PBS 50 ul damla e uterin boru ve 28 gauge iğne kullanılarak 0.1 mm parçalar halinde kıyma. 200 ul sindirim tamponu 1 (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) F12 (Ham) ortamı 300 birim ml -1 kollajenaz ve 100 ünite ml -1 Hyaluronidaz ile takviye edilmiş) ve transfer, bir% 5 CO, 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe 2 inkübatör. İnkübasyondan sonra, 1 mi,% 0.25 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 1 ml pipet ucu (aka mavi ucu), 3 dakika boyunca 20 kez yardımıyla çözelti askıya. (Ham) ortamı,% 2 fetal sığır serumu içeren 5 ml, + 4 ° C DMEM / F12 ekleyin. ((Ham) ortamı 7 mg ml -1 Dispase II ve 10 ug ml -1 Deoksiribonükleaz I ile takviye santrifüj (600 RCF, 5 dakika, oda sıcaklığında (RT)), dokuları toplamak ve 1 mi sindirim tamponu 2 (DMEM F12 ekleme DNase I)). 1 ml pipet ti yardımıyla doku topağı 20 kez Askıyas. 5 ml serum barındırmayan tüm fare tüp epitel büyüme ortamı (M-TE-GM, Tablo 1) ekleyin. santrifüj hücreleri (600 RCF, 5 dakika, RT) toplayın. askıya alma ve hemasitometre hücreleri saymak, 1 ml M-TE-GM ekleyin. Tohum 1 x 10 5, 24, alçak bağlanma plakasında çukur başına 1 ml hücre ve 4 gün boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de M-TE-GM inkübe edin. Her gün orta değiştirin. Β-aktin EGFP ya da β-aktin-DsRed farelerden kültürlenen birincil süspansiyonu TE hücreleri tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. 24-iyi düşük bağlanma plakaları TE süspansiyon kültürleri toplayın. 1 mi% 0.25 tripsin-EDTA ile santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ve askıya hücre peletleri. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin. 5 ml DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ekleyerek tripsin aktivitesi durdurun. Santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ile hücre pelletleri toplayın. Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C), 4 ml, hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. Buz üzerinde çalışarak, 10 ul PBS 1 x 10 5 hücre ekleyin, daha sonra 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. Not: steril koşullar altında bir Biyogüvenlik kabini içinde tüm diseksiyon ve doku kültürü çalışmaları yapın. Ölümsüzleştirilmiş insan hücre hattı hazırlanması Ayrıca büyüme lentivirüs EGFP ve -mCherry etiketli insan immortalize over yüzey epitel hücresi lineHIO118 80 kadar – bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 10 cm yemekler% 90 konfluansa. 10 ml PBS ile iki kez bulaşık yıkama, çanak başına 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 10 dakika inkübe edilir. 10 mi DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Toplamaksantrifüjle hücre topakları (600 RCF, 5 dakika, RT). Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C) 10 ml hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. Buz üzerinde çalışarak, 1.0 x 10 6 Lenti mCherry etiketli hücreleri + 1.0 x 10 6 Lenti EGFP 10 ul PBS hücreleri etiketli ekleyin. 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. Rahim Tüp hazırlanması 1.1.1-1.1.5 adımlarda açıklandığı gibi, 6- PBS içinde 8 haftalık bakire β-aktin-DsRed farelere ayrı ayrı rahim tüpleri teşrih. Bir diseksiyon mikroskobu altında PBS 200 ul damla içine tek rahim tüpleri aktarın. Yavaşça Mezosalpinksi, rahim tüp segmentleri destekleyen geniş ligament bir kısmını kaldırarak cımbız ve 28 gauge iğne yardımı ile rahim tüpleri uncoil. 2 bir damla tek kıvrıldığı rahim tüpleri yerleştirin00 ul buz gibi soğuk PBS alıcının yumurtalık yağ yastığı maruz kalan ve nakli için hazır kadar. 2. Yumurtalık Fat Pad Nakli Not: Her hayvan cerrahisi arasındaki aletleri dezenfekte edin. Hazırlayın ve önceden tüm ekipmanı düzenlemek. Bu dalak önler olarak sağ over yağ yastığı dorsal transplantasyon tercihli vardır. Ancak, alıcılar hem yumurtalık yağ takviyesinde nakli olabilir. singeneik fareler veya birincil hücre alıcıları olarak ağır kombine immün yetmezlik (SCID / NCR) fareler kullanın. insan hücreleri gibi HIO118 hücreleri kullanımı Nod / SCID / gama (NTG) fareler veya SCID fareleri için. 0.15 ml / 10 g vücut ağırlığı dozunda 2,2,2-tribromoetanol tek bir intra-peritonal enjeksiyon, alıcı fare anestezisi. hayvan kaput, bir ısıtma pedi üzerinde hayvan koyun ve pedal refleks (ayak tutam) kaybı ile doğru anesthetization onaylayın. ise kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürünhayvan anestezi altında olduğunu. ameliyat sonrası ağrı tedavisi için 4 mg / g vücut ağırlığı dozunda analjezik Ketoprofen hayvan deri altına enjekte edilir. Not: Alternatif olarak, anestezi izofluran kullanımı. indüksiyon odasında hayvan koyun ve 0.8-1.5 L / dk ve% 2-3 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlayın. , Odasından anestezi hayvan kaldırmak o zaman ameliyat başlatmak, bir maskeden izofluran nefes ve 0.4-0.8 L / dk ve% 1.5 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlamanızı sağlar. 40. makası ile cerrahi alan Tıraş; , Bir alandan 2 kez cerrahi alan saç kaldırmak% 70 etanol ve ardından povidon-iyot üç antiseptik scrubs ile traş cildi hazırlamak ve steril bir örtü ile kaplayın. Biyogüvenlik kabini içinde bulunan bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan taşımak. doğrudan yumurtalık yağ yastığı üzerinde dorsomedial pozisyonda bir kesi ile üreme yolu Açığa. Not: Critical adım: Hassas cilt kesi yara iyileşmesini kolaylaştırır, bir neşter kullanılması aşamasında 2.4 tavsiye edilir. Kullanarak künt ince forseps sinirler ve büyük kan damarları zarar minimize dikkatle orta çizgisine doğru kesikten yumurtalık yağ yastığı çekin. Kritik Adım: kanama oluşursa, ameliyat durdurmak ve farklı bir konak hayvana nakli düşünün. 28 ayar eğimli iğne yardımı ile diseksiyon mikroskobu kontrolü altında yumurtalık yağ yastığı içine 2-4 mm derinliğinde kesi, yumurtalık üzerinde 3-4 mm yapmak. Kritik adım: kesi sadece yağ yastığı yarısı geçer emin olun; alt tarafa tüm yol boyunca delme sızıntı olur. hızlı olun ve bu aşamadan sonra gecikmeden devam edin. hücre nakli için, hücre bazal membran matris karışımı 10-20 ul bir şırınga (30 iğne) doldurmak ve yağ yastığı kesi içine enjekte edilir. rahim tüp nakli için, rahim tüp zekâ pick uph ince forseps ve 10 yer – 20 ul bazal membran matrisinin buz üzerinde tutulmalıdır. Bir 0.1-10 / 20 ul kullanarak XL (3 mm kısaltılmış) filtre ucu doku ve taban membran matris süspansiyonu pick up ve yağ yastığı kesi içine bırakın mezun oldu. bazal membran matris kuvvetlendirmek ve geri periton içine üreme yolu yerleştirmek için 5 dakika bekleyin. 2 cerrahi sütür stiches ve iki küçük yara klipleri veya cerrahi sütür ile deri ile kasların kapatın. Tekrarlayın kontrol olarak görev yapacak hayvan kontra yanal yağ yastığı içine PBS-bazal membran matris karışımı nakli 2.4-2.8 adımları tekrarlayın. Kritik adım: ısı kaybı anestezi farelerde hızlıdır çünkü Ameliyattan sonra bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin. Hayvan yerli kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde kurtarmak ve anestezi tamamen uyanık kadar hayvan inceleyelim. o sterna korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınl recumbence. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. Ameliyat sonrası kafese yiyecek kuru ek olarak kafes içinde ön-ıslak gıda pelet bir avuç koyun. Önümüzdeki birkaç gün için gerekirse ameliyat sonrası analjezik uygulayın ve günlük yara inceleyin. yara enfeksiyonu oluşursa onaylı hayvan protokole göre antibiyotik uygulayın. Yara tamamen kapalı olduğunda ameliyat sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın. 3. Histoloji ve Image Acquisition Greft Toplanması ve Korunması 4 mi 10x PBS ve 10 ml% 16 paraformaldehit çözeltisi ile 26 ml GKD 2 O karıştırılarak% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın. Bir blok aşılanan yumurtalık yumurtalık yağ yastığı, uterin tüp, 1.1.1-1.1.4 adımda tarif edildiği gibi, 0.5 cm rahim teşrih. Hemen 2 mi% 4 paraformaldehid içinde yer ve oda sıcaklığında, 2 saat süre ile düzeltin. Aynı hayvandan olmayan engrafted teşrihBir kontrol olarak PBS-bazal membran matris karışımı ile nakledilen kontralateral over yağ yastığı sistemi (adım 2.9 bakınız). Düzeltmek ve aynı şekilde işlem. sabitleme yıkamadan sonra, 5 dakika boyunca PBS ile üç kere, doku ve 4 ° C de PBS içinde bir gece boyunca inkübe edilir. yumurtalık yağ yastığı tüm montaj görüntüleme için 3.2.1 adıma geçin. Not: görüntü alma dokular dondurulmuş olabilir sonra (3.3.1) ya da parafine (3.3.2) için işlenmiş. 4 ° C'de PBS içinde% 30 sukroz içinde bir gece inkübasyon donmuş dokular kalitesini artırır. Görüntü edinme Bir floresan eki, renkli kamera ve Plan ile donatılmış 4, 10x hedefleri ve stereomikroskopta, epi-floresan eki ve yüksek çözünürlüklü renkli kamera ile donatılmış PBS dolu yemekleri ve ters bir mikroskop kullanılarak görüntüde yumurtalık yağ yastığı sistemleri-bütün montaj yerleştirebilirsiniz apo 1xWD70, ED Planı 1.5xWD45 hedefleri. histoloji Takip etmetüm montaj görüntü toplama (3.2.1) Laboratuvar film ve forseps kullanarak bir 2 x 1 cm parçası üzerinde dondurulmuş doku örnekleri için orta gömme bir 200-500 ul damla yerleştirin damlasına kadar doku aktarın. bir kenarda filmi Pick up ve 1.8 ml kriyojenik flakon doku orta damla aktarın. şişeyi kapatın ve sıvı azot içine dalma. -80 ° C'de donmuş dokular saklayın. Alternatif olarak, standart parafine devam edin. Her adım için doku hacminin 20-40 hacimleri kullanın. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 65 etanol içerisinde dokuların bırakın. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 70 etanol içinde dokuların bırakın. Bu aşamada örnekler oda sıcaklığında ay depolanabilir. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 90 etanol içerisinde dokuların bırakın. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 95 etanol içinde dokuların bırakın. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca iki kez mutlak etanol (200 proof) içinde dokuların bırakın. <li> RT'de hafifçe sallayarak, 30 dakika boyunca kloroform iki kez dokuları daldırın. 58 ° C 'de yavaşça çalkalanarak 30 dakika için parafin içine bir kez dokuları bırakın. 58 ° C 'de yavaşça çalkalanarak 12 saat için parafin içine bir kez dokuları bırakın. 58 ° C 'de, 3 saat parafin kez dokuları bırakın. Metal histoloji kalıplarında dokuları koyun ve 58 ° C parafin ile kalıpları doldurun. parafin üstüne plastik bir histoloji kaseti ekleyin ve + 4 ° C'ye kadar parafin soğutmak. Oda sıcaklığında parafin doku blok ve mağaza ayıklayın. Not: Parafin sıcaklığı immünohistokimyasal için uygun dokuda optimal korunması için 58 ° C'yi geçmemelidir. Alternatif olarak, Örnek İşleme Jel ile Parafin Gömme hazırlanın. PBS aspire ve% 70 etanol ile tüm montaj dokuları aktarın. 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. bir su banyosu içinde, ön-ısıtma numune, 60 ° C'ye jel işlem. Pipette laboratuar film kaplı Petri kabı üzerine numune işleme jel 200 ul. Kullanarak ince diseksiyon forseps numune işleme jel düşmesi tüm montaj doku sistemini aktarmak. örnek işleme jel yatağından oda sıcaklığında katılaşan, ya da 4 ° C 'de 10 dakika süre ile fiş katılaşmasına izin verin. biyopsi köpük pedler arasına sıkıştırılan histoloji doku kasetlerde örnek işleme jel gömülü doku yerleştirin. adımlarda 3.3.2-3.3.2.10 gibi parafin gömün. Not: Numune işleme jel gömme kaybını önler ve küçük kırılgan doku örneklerinin korunmasını sağlar. Not: dondurma ya da parafine korunmuş dokular immünohistokimyasal 14,15 için uygundur.