使用F9稀土LACZ基于Cell的报告基因检测在E8.5胚胎和神经球文化相对维甲酸水平的定量测量

所有的动物工作是按照批准罗格斯-RWJMS IACUC方法进行。 1.解决方案和媒体准备准备库存和缓冲溶液按表1。按表2准备工作的解决方案。 2.文化和F9稀土的LacZ细胞的维持 解冻冷冻细胞 如表2中详述的制备F9稀土LacZ的细胞培养基。 外套10厘米培养皿（处理过的细胞培养物）用10毫升的0.2％明胶（参照表2）进行30分钟，在室温。洗去多余的明胶用10毫升蒸馏水水两漂洗。立即加入9毫升F9稀土的LacZ细胞培养基到烧瓶中，以防止干燥的明胶。 3分钟-在37℃水浴中2解冻F9稀土的LacZ细胞14的小瓶。板的细胞（约1×10 6个细胞/ ml）到涂覆菜Containing9毫升培养基。在37℃下培养，5％ 的 CO 2。改变介质的第二天。 F9稀土的LacZ细胞的维持 以1:10的比为3天 – 保持有规律的通路，每2。 注意：不要让细胞长成汇合，因为这会导致其分化。 分裂培养物在80-90％铺满。删除媒体并用10ml 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。移除PBS并加入胰蛋白酶1毫升，孵育5分钟。再加9毫升培养介质中，吸移管的上下和分裂细胞1:10进行传代。 冷冻F9稀土LacZ的细胞 Trypsinize含有F9稀土的LacZ细胞在80 10 cm培养皿 – 90％汇合如在步骤2.2.2详述。转移离解的细胞入15ml离心管中并旋转，在200×g离心5分钟。 在10毫升F9稀土的LacZ的F取出上清，悬浮细胞沉淀reezing培养基（ 见表2）。分装1毫升到标有冷冻管并转移到小瓶冷冻容器。将第二天-80℃冰箱O / N和转让小瓶液氮罐中冷冻集装箱。 3. E8.5胚胎解剖 笼交配设置和检查插头 设置含有一种交配对配合笼。第二天上午，检查阴道塞的存在和指定日的插头被发现为0.523天 。在E8.5天，收获的胚胎。 胚胎解剖 牺牲通过颈脱位水坝和喷雾用70％乙醇腹部区域（ 见表 2）。使削减用手术剪在腹部上方的皮肤和横向拉开两片（前部和后部），露出腹部。作出类似的削减在腹膜以露出腹部。 找到子宫和输卵管子宫释放，并使用剪刀23系膜及。放置在用10ml 6cm皿（处理过的非细胞培养物）的子宫1×PBS中洗掉多余的脂肪和血。转移到含有新鲜10毫升1X PBS另外6 cm培养皿。 单独通过削减其关闭用手术剪刀包含一个胚胎中提取一个子宫。切除子宫及蜕膜和释放含有使用两对无胚胎卵黄囊。 5镊子23。 从胚胎中分离卵黄囊和卵黄囊转移到1.5ml微量离心管中用于基因组DNA提取将用于基因分型。使用P20吸管用大口径尖，整个胚胎移植到含有10微升胰蛋白酶的1.5 ml离心管。放置在冰上的管中。 重复步骤3.2.3 – 3.2.4，直到所有的胚胎都被解剖。 胚胎离解孵育含有胰蛋白酶的胚胎1.5毫升管在37℃下5分钟，以促进酶解。 磨碎轻轻使用用于胚胎机械解离一个P20移液器，和板含有一个解离的胚胎在F9稀土的LacZ细胞的一个孔在96孔板在整个10微升体积（见步骤5.1电镀F9稀土的LacZ细胞在一个96孔板）。培养O / N在37℃和5％的CO 2。 4.椎板切除术，成人的解剖腰脊髓神经球和文化 椎板切除术 通过颈椎脱臼牺牲一个成人（P60）鼠标。 喷雾用70％乙醇的背侧，并用手术剪一个横向切割。拉活板（前部和后部）分开，露出背部和脊柱。 用手术剪刀，剪掉覆盖脊椎的肌肉。定位脊髓的腰部区域，肋的下方。使用剪刀，做一个深深的伤口，以切断脊椎在这一点上暴露脊髓。 拉起脊柱的腰部区没有。 5钳子使得脊髓的露出横截面朝向实验者。用细剪刀提示，剪断在露出端的3点钟和9点钟位置的脊椎和肌肉。抓住用钳子切断脊椎的背部皮瓣。直到脊髓腰段的长度露出尾部继续这些削减。 不使用从椎骨释放脊髓。 5以及钝端钳。脊髓转移到装有3毫升的DMEM / F12培养基的15毫升管。保持冰，直到所有的腰椎脊髓已被隔离。 脊髓解剖 倾与脊髓培养基成6cm皿（无细胞培养物处理的）。 下一个立体显微镜，通过抓住使用两对无神经节和血管移除脊髓周围段背根神经节和血管。 5镊子轻轻地从脊髓拉着他们离开。转移脊髓段到一个直径6cm培养皿没有介质和细使用手术刀刀片剁碎的组织。 转移组织糜到含有1ml的神经球的解离介质15毫升管（ 见表2）。把管冰，并重复步骤4.2.1 – 4.2.2，直到所有脊髓已被处理。 孵育含离解培养基组织糜管在37℃下进行10分钟，轻弹的一侧的管进行混合，然后在37℃孵育另外10分钟。经过酶消化，用磨碎的直径减小机械解离火抛光移液器。 注：准备递减之前进行实验直径火抛光的吸管。以一个玻璃巴斯德吸管和插头广角端用干净的棉花。使用酒精灯，火抛光在火焰中移液器的提示，以创建不同直径：“常规”，“精”和“超等”。对于“常规”抛光移液器，捻在火焰向圆边缘的移液管的端部不降低直径（约1毫米）。旋转中的火焰要略微较长的吸移管的端部以创建“精”（〜>在1mm和>直径5mm）和“超细”（〜0.5mm）的抛光移液器。不要用直径小于0.5mm使用吸管。 神经干文化 含有降速管解离脊髓组织在200×g离心10分钟。在1ml神经球培养基除去上清，重悬细胞沉淀（ 见表2）。用P1,000吸管后跟P200移液管，以促进分解磨碎。 注意：避免产生气泡，这会降低细胞活力。 转移10微升解离的细胞的成血球和获得细胞计数。板的细胞在用10毫升神经球培养基的T25烧瓶中的1×10 5/10 ml的密度。在37℃和5％CO 2的7天，直到神经球出现24。 神经球离解 收集神经球文化和转移到15 mL管。旋转，在200×g离心10分钟。去除大部分上清留下1毫升后面。用P1,000吸管磨碎到重悬细胞沉淀并分离神经球成单个细胞。转移10微升解离的细胞的成血球并获得细胞计数。 板1×10 5解离的神经球细胞过度F9 RARE-LacZ的的一个孔在96孔板（见5.1中96孔板电镀F9 RARE-LacZ的）。板3口井的重复。培养O / N在37℃和5％的CO 2。 5. E8.5胚胎脊髓神经球的RA含量 电镀F9稀土LacZ的在96孔板 前一天收获E8.5胚或神经球的解离，涂布96孔板用100μl每孔的0.2％的明胶在室温30分钟。吸出明胶，并用200微升蒸馏水淋洗两次。 Trypsinize F9稀土LacZ的细胞保持10 cm的培养皿如步骤2.2.2详细说明。板1×10 5细胞/孔的F9-RARE LacZ的细胞，但使用培养基不含G418这个时候。 准备足够的井胚胎共培养（〜12 – 20，取决于产仔），神经球（3孔/基因型），以及用于在一式三份的标准曲线（27孔）。 F9稀土的LacZ和E8.5胚胎或脊髓神经球共培养 详见3.2节和板块上的F9顶部收获胚胎稀土的LacZ从5.1节的96孔板。以类似的方式，解离于在步骤4.4作为详细的96孔板F9 RARE-LacZ的顶部神经球和盘。培养O / N在37℃和5％的CO 2。 生成标准曲线 100纳米，10纳米，1纳米，100点，10点，下午1点，100 FM，由AT-的连续稀释：要生成一个标准曲线，具有以下浓度的准备全反式RA（AT-RA）解决方案RA股票（ 见表1）F9稀土LacZ的培养基。 AT-RA浓度从5.1节加入100μl这些不同的到F9稀土LacZ的细胞。指定一个包含未处理F9稀土LacZ的细胞作为阴性对照井。制备各RA浓度和阴性对照孔的一式三份。培养O / N在37℃和5％的CO 2。 注意：F9 RARE-LacZ的细胞以剂量依赖的线性方式不同浓度的全 – 反式RA的响应。 RA含量 含有标准曲线和共培养的96孔板的O / N培养后，取出介质，并通过加入100微升2.5％的戊二醛固定的培养物（ 见表2）15分钟，室温。取出固定液，并用200微升1×PBS，每洗10分钟，洗两次澡。 除去PBS中，并用200微升的LacZ洗涤溶液洗涤三次（ 见表2），每次洗涤10分钟。在第三次洗涤，准备在一个15毫升管包裹在箔的X-gal染色溶液（ 见表2）。计算多少染色液需要并准备适当的量（200微升/孔）。 注意：X-gal的染色液是光敏感。制备后用15分钟内的染色溶液。 通过将用蒸馏水蘸纸巾移入塑料容器大到足以容纳一个96孔板制备的潮湿室中。加入200μl在X的每96孔板的半乳糖苷酶染色溶液并将板在湿润的腔室中。 孵育加湿室含有96孔板在37℃，以允许的蓝色的沉淀物的发展。对于E8.5胚胎，孵育板O / N（12 – 16小时）。对于神经球文化，孵育4板 – 8小时。 在OD 610和成像读取吸光度 显色反应后，取出的LacZ染色溶液和用200μl1×PBS中进行更换。使用标准ELISA板读数器来量化记者响应于RA的测量在610纳米的吸光度。图像单个孔使用装备有相机的标准立体显微镜。 6.亚克隆F9稀土的LacZ细胞 检查F9稀土的LacZ rResponse到RA 在开始任何实验之前，先测试F9稀土LacZ的细胞对RA的响应。板F9稀土的LacZÇ在96孔板厄尔（参见5.1节），并添加1纳米全反式维甲酸（见步骤5.3）。在37℃CO / N孵育在湿润的腔室中。 可视化使用显微镜蓝色沉淀的发展。如果颜色发展不贯穿孔中的细胞均匀（参照图1B，左），执行下面亚克隆详述。 F9稀土的LacZ细胞的亚克隆 斯普利特10 cm的培养皿中培养的F9稀土LacZ的细胞作为步骤2.2.2详细说明。代替1:10的比例的，板1×10 5个细胞/ 10毫升的低接种密度在10cm皿以允许分离的菌落的生长，使得每个集落产生从单个F9稀土的LacZ细胞。 两天后，涂布24孔板用500μl每孔的0.2％明胶的30分钟。除去明胶溶液，并用500微升蒸馏水冲洗孔两次。用500μlF9稀土LacZ的细胞培养基的更换水。 挑选使用无菌P10的枪头和转让到一个很好的殖民地;做24次，得到24个独立的殖民地。培养在37℃，3，5％CO 2 – 4天。 拆分单个菌落成两个24孔板。后在培养2天后，添加的RA为1nm至之一24孔板和培养O / N各孔中。按照第5.4节详述，以测试高反应进行的LacZ染色。每个可视化的显色反应以及在显微镜下才能确定强和均匀的响应。 一旦一个强亚克隆响应被确定，从另一24孔板展开相应的培养。进一步扩大在10cm皿的殖民地，冻结下来几个小瓶在2.3节详述，并放弃所有其他殖民地。 注意：只有关于原始菌落的四分之一导致高​​反应者。典型地，第一轮亚克隆不导致均匀的LacZ染色，并需要随后的轮亚克隆需做达到均匀强烈反应。