We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Vi beskriver en låg kostnad, konfigurerbar morbidostat för att karakterisera den evolutionära vägen för antibiotikaresistens. Den morbidostat är en bakteriekultur enhet som kontinuerligt övervakar bakterietillväxt och dynamiskt justerar läkemedelskoncentrationen att ständigt utmana bakterier eftersom de utvecklas att förvärva läkemedelsresistens. Enheten har en arbetsvolym av ~ 10 ml och är helt automatiserad och utrustad med optisk densitet mätning och mikropumpar till mellanstora och drug delivery. För att validera plattformen, mätte vi stegvis förvärv av trimetoprim motstånd i Escherichia coli MG 1655, och integreras enheten med en multiplex mikroflödes plattform för att undersöka cellmorfologin och antibiotikakänslighet. Tillvägagångssättet kan skalas upp till laboratoriestudier av antibiotika resistens, och är utdragbara för adaptiv evolution för stam förbättringar i metabolisk ingenjörskonst och andra bakteriekultur experiment.
Sedan introduktionen av den första antibiotikum penicillin, har mikrobiell antibiotikaresistens utvecklats till ett globalt hälsoproblem 1. Även förvärvet av antibiotikaresistens kan i efterhand studeras in vivo, är villkoren för dessa försök ofta inte kontrolleras hela evolutionen 2. Alternativt kan adaptiv laboratorium evolution avslöja molekylär evolution av en mikrobiell art enligt miljöpåfrestningar eller selektionstryck från ett antibiotikum läkemedel 3. På senare tid har många välkontrollerade evolutionära experiment av antibiotika resistens klar uppkomsten av antibiotikaläkemedelsresistens. Till exempel, Austin grupp visade snabb framväxt i en korrekt konstruerad mikroflödesfack miljö 4. Den nyutvecklade morbidostat inducerar systematiska mutationer enligt läkemedelsselektionstryck 5,6. Den morbidostat, en mikrobiell selectionsanordning som kontinuerligt justerar antibiotikakoncentrationen att upprätthålla en nästan konstant befolkning, är ett stort framsteg från fluktuationer test som används i mikrobiologi 7,8. I fluktuationen test, ett antibiotikum läkemedlet injiceras vid hög koncentration, och de överlevande mutanter screenas och räknas. Istället mikrober i en morbidostat ständigt utmanas och förvärva flera mutationer.
Den morbidostat fungerar på samma sätt som kemostat, en kultur anordning uppfanns av Novick och Szliard 1950 som upprätthåller en konstant befolkning genom att kontinuerligt tillföra näringsämnen samtidigt späda den mikrobiella populationen 9. Sedan introduktionen har kemostaten förts fram och förbättras. Aktuella mikroflödes kemostater har nått nanoliter och encelliga kapacitet. Emellertid är dessa anordningar är olämpliga för adaptiv evolution experiment, vilka kräver en stor cellpopulation med många mutationshändelser 10,11. Nyligen, mini-kemostater med arbetsvolymer ~ 10 ml har också utvecklats för att fylla gapet mellan liter skala bioreaktorer och mikroflödes kemostaten 12,13.
Här presenterar vi utformningen och användningen av en låg kostnad, automatiserad morbidostat för en antibiotisk läkemedelsresistens studien. Den föreslagna Modulen kan användas i en skakinkubator i ett mikrobiologiskt laboratorium med krav minimal hårdvara. Öppen källkod firmware är också lätt anpassas till specifika tillämpningar av adaptiv evolution, såsom metabolisk teknik 3. Slutligen är morbidostat integreras i en multiplexerad mikroflödes plattform för antibiotikakänslighetstestning 14.
En låg fotavtryck morbidostat enhet från lågkostnadskomponenter demonstreras. Ökningarna i läkemedelsresistens nivå som registrerats av enheten överensstämmer med de tidigare rapporter 5. Designad för evolutionära studier av läkemedelsresistens, är enheten potentiellt tillämpas på många andra experiment. För det första kan fastställas en omfattande databas av läkemedelsinducerade mutationer för ett stort antal kliniskt relevanta antibiotika. Till exempel, kan det evolutionära reaktionsvä…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
Cadamino Acid | BD | Medium | |
glucose | Sigma | ||
Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
Luria Bertani medium | |||
Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
ELISA plate reader | |||
two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
Trimethoprim | Sigma | ||
Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |