Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci
Summary
We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Abstract
Descriviamo un basso costo, morbidostat configurabile per caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici. Il morbidostat è un dispositivo di coltura batterica che controlla continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione di farmaco di sfidare costantemente i batteri si evolvono per acquisire resistenza ai farmaci. Il dispositivo è dotato di un volume di lavoro di ~ 10 ml ed è completamente automatizzato e dotato di misura della densità ottica e micro-pompe per medio e la somministrazione di farmaci. Per convalidare la piattaforma, abbiamo misurato l'acquisizione graduale della resistenza trimetoprim in Escherichia coli MG 1655, e integrato il dispositivo con una piattaforma microfluidica multiplex per indagare la morfologia cellulare e sensibilità agli antibiotici. L'approccio può essere up-scalata a studi di laboratorio di resistenza ai farmaci antibiotici, ed è estendibile a adattivo evoluzione per i miglioramenti di deformazione in ingegneria metabolica e altri esperimenti di coltura batterica.
Introduction
Dal momento che l'introduzione del primo penicillina antibiotico, microbica resistenza agli antibiotici è trasformata in un problema di salute globale 1. Sebbene l'acquisizione di resistenza agli antibiotici può essere studiato retrospettivamente in vivo, le condizioni di questi esperimenti sono spesso non controllati durante l'intera evoluzione 2. In alternativa, adaptive evoluzione di laboratorio può rivelare l'evoluzione molecolare di una specie microbiche sotto stress ambientali o pressione selettiva da un farmaco antibiotico 3. Recentemente, molti esperimenti evolutivi ben controllati di resistenza ai farmaci antibiotici hanno chiarito la comparsa di resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, il gruppo di Austin ha dimostrato rapido emergere in un microfluidica correttamente progettato ambiente compartimenti 4. Il morbidostat recentemente sviluppato induce mutazioni sistematiche sotto farmaco pressione selettiva 5,6. Il morbidostat, un Selec microbicaDispositivo zione che regola continuamente la concentrazione di antibiotico per mantenere una popolazione quasi costante, è un importante progresso dal test di fluttuazione utilizzato in microbiologia 7,8. Nel test di fluttuazione, un antibiotico viene iniettato ad alta concentrazione, ei mutanti sopravvissuti sono schermate e contati. Invece, i microbi in un morbidostat sono costantemente in discussione e acquisiscono mutazioni multiple.
Il morbidostat funziona in modo simile al chemostat, un dispositivo di cultura inventato da Novick e Szliard nel 1950 che mantiene una popolazione costante fornendo continuamente nutrienti mentre diluendo la popolazione microbica 9. Fin dalla sua introduzione, il chemostat è stata avanzata e migliorata. Attuali chemostati microfluidica hanno raggiunto capacità nanolitri e unicellulari. Tuttavia, questi dispositivi non sono adatti per esperimenti evoluzione adattativa, che richiedono una grande popolazione di cellule con molti eventi mutazione 10,11. Recentemente, mini-chemostati con volumi di lavoro del ~ 10 ml sono stati sviluppati per colmare il divario tra bioreattori scala litri e la microfluidica chemostat 12,13.
Qui vi presentiamo la progettazione e l'utilizzo di un basso costo, morbidostat automatizzato per uno studio della resistenza ai farmaci antibiotici. Il modulo proposto può essere impiegato in un incubatore shaker in un laboratorio di microbiologia con requisiti hardware minimi. Il firmware open-source è anche facilmente su misura per applicazioni specifiche di evoluzione adattativa, come l'ingegneria metabolica 3. Infine, il morbidostat è integrato in una piattaforma microfluidica multiplato per i test di suscettibilità antibiotica 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositivo morbidostat a basso impatto da componenti a basso costo è dimostrata. Gli aumenti di livello resistenza ai farmaci registrati dal dispositivo sono coerenti con quelli di precedenti rapporti di 5. Progettato per gli studi evolutivi di resistenza ai farmaci, il dispositivo è potenzialmente applicabile a molti altri esperimenti. In primo luogo, un database completo di mutazioni indotte da farmaci può essere stabilita per un ampio insieme di antibiotici clinicamente rilevanti. Ad esempio, il per…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Materials
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
| Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
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