Transkriptions-Analyse von RNA Nascent FISH<em> In Vivo</em> Trophoblast-Riesenzellen oder<em> In Vitro</em> Kurzfristige Kulturen von Ectoplacental Cone Explantate
Summary
Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Abstract
Die Plazenta leitet sich von einer extraembryonalen Linie, die Trophektoderm. In der peri-Implantation murine Blastozysten, unterscheiden Wand Trophektoderm Zellen in primäre trophoblast Riesenzellen (TGCs), während die polare Trophektoderm der inneren Zellmasse liegt, später zu wuchern weiter in sekundäre TGCs unterscheiden. TGCs spielen eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der Plazenta und sind essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft. Untersuchung der Transkriptionsregulation bestimmter Gene während nach der Implantation Entwicklung kann Einblicke in TGCs geben Entwicklung. Zellen des ectoplacental Kegels (EPC) von Embryonen bei 7-7,5 Tagen der Trächtigkeit (E7-7.5), von dem polaren Trophektoderm abgeleitet, differenzieren sich in Sekundär TGCs 1. TGCs kann in situ auf Kryostatschnitten von Embryonen bei E7 untersucht werden , obwohl die Anzahl von TGCs in diesem Stadium sehr niedrig ist. Ein alternatives Mittel sekundären TGCs der Analyse ist kurzfristige Kulturen einzelner EPCs von E7 Embryo zu verwenden,s. Wir schlagen vor , eine Technik , die Transkriptionsstatus von Genen von Interesse in vivo sowohl und auf der Ebene einzelner Zellen in vitro zu untersuchen , unter Verwendung von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (RNA FISH) im Entstehen begriffenen Transkripte zu visualisieren. Diese Technik liefert eine direkte Auslesung der Genexpression und erlaubt die Beurteilung der chromosomalen Status TGCs, die große endoreplicating Zellen sind. Tatsächlich ist ein wesentliches Merkmal der terminalen Differenzierung von TGCs, dass sie den Zellzyklus zu verlassen und durchlaufen mehrere Runden von endoreplication.This Ansatz kann angewendet werden, um Expression eines beliebigen Gens von Autosomen und / oder Geschlechtschromosomen exprimiert zu erkennen und wichtige Informationen in Entwicklungs liefern Mechanismen sowie Plazentakrankheiten.
Introduction
Mammalian trophoblast Riesenzellen (TGCs) eine Barriere zwischen mütterlichen und embryonalen Geweben bilden. Sie vermitteln die Implantation und die Invasion des conceptus in die Gebärmutter und spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung für die Bildung der Plazenta. Sie produzieren verschiedene Wachstumsfaktoren (Zytokine) und Hormone der Prolactin / Placentalactogen Familie und Steroide, die für embryonale Wachstum und Überleben. TGCs sind groß, einkernigen und polyploiden Zellen mit einem Zellzyklus, der endocycle, dass S und G Phasen im Wechsel besteht. Tatsächlich TGCs sind endoreplicating Zellen, in der Lage 2 ohne Teilung mehrere Runden der DNA – Synthese zu unterziehen. Um die Transkriptionsstatus von Genen in vivo, in TGCs Vergleich zu anderen embryonalen und extraembryonale Zelltypen, naszierende RNA FISH zu untersuchen , können in vivo auf Kryostatschnitten 3 an bestimmten Postimplantationsschritte durchgeführt werden. TGCs sind leicht erkennbar auf Abschnitte aufgrund their Größe und ihre Transkriptions Genaktivität kann aufgezeichnet werden, aber ihre Zahl in frühen Stadien nach der Implantation ist gering. Mangel an TGCs auf E7 embryonalen Abschnitte, führte uns kurzfristige Kulturen von embryonalen trophectodermal Gewebe auszuführen differenzierte TGCs zu erhalten, um die Regulation der Genexpression während der Trophektoderm Entwicklung zu studieren. Darüber hinaus, um möglichst physiologischen bleiben, etablierte Zelllinien, dh Trophektoderm Stammzellen (TS) sind nicht immer geeignet Entwicklungsmechanismen Generation zu untersuchen sekundärer TGCs ein wertvolles Hilfsmittel für pathologische Schwangerschaften mit Defekten in TGCs durch abnorme Gen assoziiert zu studieren Regulierung bei Mäusen.
Trophoblastzellen des ectoplacental Kegel (EPC) sind Vorläufer von sekundären TGCs 4. Spontane Differenzierung von kultivierten EPCs zur sekundären TGCs zuvor 5 berichtet. Jedoch im Gegensatz zu primären TGCs, Studien über Sekundär TGC differenhandlungen haben begrenzt geblieben, presumablydue auf die Schwierigkeiten der frei von mütterlichen oder embryonalem Gewebe EPC Explantate zu isolieren. Wir passten diese Methoden, um RNA-FISH auf Sekundär TGCs aus einzelnen Embryo in E7, eine Entwicklungs nach der Implantation Stadium, in dem TGCs sind nur sehr wenige abgeleitet ausführen konnte aber von EPC-Vorstufen erzeugt werden. RNA-FISH Kern Primärtranskripte zu analysieren hat nie auf der Ebene der Einzelzellebene auf Sekundär TGCs geschehen. Dies ermöglicht eine genaue Analyse der Transkription und wurde 3 verwendet die epigenetische Instabilität von TGCs bei Postimplantationsstadien zu zeigen.
Ein klassisches Beispiel für die Epigenetik bei Säugetieren, das X-Chromosom – Inaktivierung (XCI) im Heard Labor 6 untersucht. Bei diesem Verfahren eine der zwei X-Chromosomen in weiblichen inaktiviert. Die nicht codierende Transkript Xist beschichtet das X – Chromosom , von dem sie in weiblichen Zellen exprimiert und löst silencing der meisten Gene. Mit RNA-FISH,Entstehen begriffenen Transkripte von X-chromosomale Gene können wie auch die Anhäufung von Xist – RNA auf dem inaktiven X – Chromosom (Xi) untersucht werden. Wir beschreiben hier ein Verfahren zur RNA-FISH auf Abschnitten nach der Implantation Embryonen und auf Kurzzeitkulturen von EPC durchführen. Dieses Protokoll von denjenigen , die angepasst XCI verwendet wurden 7-11 in differenzierenden weiblichen embryonalen Stammzellen und Präimplantationsembryonen zu studieren. Wir stellen Beispiele von XCI in weiblichen Embryonen in vivo sowie in vitro TGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nascent RNA FISH stellt eine einfache und empfindliche Methode zur Einzelzellanalyse von Transkriptionsaktivität in embryonalem Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die Kraft dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, unterschiedliche embryonale Linien zu einem bestimmten Stadium zu identifizieren nach morphologischen Kriterien. Allerdings erfordert dies auch, dass minimale Hintergrundfluoreszenz vorhanden ist. Ein solcher Hintergrund macht die Identifizierung verschiedener embryonaler Regionen und Zelltypen herausfordernd. Um sicherzustellen, minimal Hintergrund gibt es zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste ist die Qualität der Kryoschnitt und die zweite ist die Effizienz (Signal-Rausch-Verhältnis) des RNA FISH, die auf der Ebene der Genexpression und der Qualität der Sonde abhängt. Für letztere sind Sonden daher immer auf kultivierten Zellen auf Deckgläsern getestet (embryonale Stammzellen oder somatischen Zellen), bevor auf Abschnitten zu verwenden.
In diesem Protokoll stellen wir the Techniken erforderlich, um RNA FISH-Analyse auf TGCs aus zwei unterschiedlichen Typen von Probenvorbereitung (Kryostatschnitten und Primärkulturen von embryonalen Explantate) durchführen. Solche Einzelzellanalyse ermöglicht die dynamische Veränderungen in der Genexpression bei verschiedenen Postimplantationsstufen bewertet werden.
Die Methoden, die wir beschreiben sekundäre TGCs zu erzeugen (bei E7-7.5 nach der Implantation Stufen) wurden in unserem Labor zur Untersuchung der X-Chromosom Inaktivierung Muster einer extra embryonale Linie verwendet, die von TGCs bei Postimplantationsstufen gebildet ist. Extra-Embryonalentwicklung in Nagetieren, hängt von der Differenzierung von TGCs. Tatsächlich sind TGCs essentiell für Plazenta und damit die embryonale Entwicklung. Defekte in TGC Differenzierung führen embryonale Letalität (zur Übersicht siehe Referenz 15). Transkriptions – Aktivität von TGCs RNA FISH erlaubt uns eine ungewöhnliche X – Chromosom Inaktivierung Status dieser Zelltyp während der Mausentwicklung 3 zu demonstrieren.
<p class = "jove_content"> Die hier vorgestellten Methoden zu erhalten und sekundäre TGCs studieren molekularen Wege zu studieren in der Entwicklung der wichtigen extra embryonalem Gewebe sind sie Teil sowohl in normalen und mutierten Mäusen angewendet werden. Diese Ansätze könnten angepasst werden TGC Entwicklung in anderen Säugetieren zu untersuchen. Unsere Analyse umfasste die Verwendung von Wildtyp – Maus – Embryonen ermöglicht es uns , die Transkriptionsaktivität verschiedener Gene in vivo in TGCs und in in vitro TGCs von EPC Explantation abgeleitet zu beurteilen. Dieses Verfahren könnte zur Analyse von transgenen Mäusen verlängert werden und / oder durch die Zugabe von Inhibitor-Moleküle in das Kulturmedium. Wir haben erfolgreich diese Methode der RNA FISH auf einer anderen Art von TGCs, wie primäre TGCs, die in einem früheren Stadium der Entwicklung der Maus, E3.0 blastocyts, die sein können einzeln kultiviert für 4-5 Tage, in denen entwickelte Auswuchs erscheinen verwendet, die ICM werden 16,17 von großen primären TGCs umgeben. Nascent Transkripte für verschiedeneGene sowie Xist visualisiert und quantifiziert werden konnte 3 die gleiche RNA – FISH – Ansatz.Kombinierte Immunofluoreszenz und RNA FISH können auch als auch in vitro kultiviert TGCs 3 auf Kryostatschnitten durchgeführt werden. Dies zeigt, daß das Verfahren ziemlich robust ist, als primäre Transkripte sehr anfällig gegenüber Abbau sind, und es ist eine absolute Voraussetzung für RNase freien Verbindungen. IF / RNA-FISH bietet weitere Informationen zur Transkription Ebenen, zelluläre Lokalisation und Proteinexpression, gleichzeitig in einer bestimmten Zelle. Obwohl die Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden bisher verwendet worden , im Entstehen begriffenen RNA in menschlichen Tumoren zu erfassen , während Gewebemorphologie Aufrechterhaltung 18, in unseren Händen, sind Cryostatschnitten besser geeignet für die Erhaltung sowohl der im Entstehen begriffenen RNA und die für den Nachweis erforderlich Epitope , die durch Antikörper bei Immun .
Zusätzlich zu den RNA-FISH, folgende imFluoreszenz, chromosomale DNA FISH kann auch auf TGCs sekundären Sonden durchgeführt werden mit Fluorochromen markiert verwenden, ähnlich denen für die RNA – FISH 3 verwendet. Fluoreszenzsonden können entweder Plasmide / Fosmide oder BACs sein, mit fluoreszierend markiertem dUTPs wie hier verwendet und beschrieben in Chaumeil et al., 8. Alternativ können fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide 19 verwendet werden. Da FISH DNA Oligonukleotidsonden einem der beiden komplementären Stränge in der Zielregion zum Ziel können nicht strang Spezifität erfordern ausgebildet sein. Verzweigte DNA – Sonden, wobei die Signalverstärkung durch zwei sequenzielle Runden von spezifischen und Verstärkersonden erreicht wird , kann auch das Signal-Rausch – Verhältnis von FISH – Signale 20 verstärkt werden. Alternativ können RNA-Sonden wie Ribosonden verwendet werden, obwohl in unserer DNA-basierten Sonden ein besseres Kompromiss zwischen Signalqualität garantieren, Spezifität und Einfachheit der Verwendung.
Schließlich 3D-Bild acquisition ist wesentlich, um die gewünschte räumliche Information in diesen großen Zellen zu erhalten, und kann unter Verwendung einer Vielzahl von Fluoreszenzmikroskopen, wie dem Apotome Mikroskop oder Epifluoreszenz-Mikroskop mit Dekonvolution durchgeführt werden, wie der Deltavision (GEH) oder andere Mikroskope geeignet zur Bebilderung Gewebeschnitte und große (> 20 um) TGCs. Es sollte für einzelne Kopie DNA-Loci, erfasst das punktierte Signal von im Entstehen begriffenen RNA FISH oder DNA-FISH kann nicht ohne weiteres durch konfokale Mikroskopie festgestellt werden, dass nachgewiesen werden.
Abschließend sollten die Methoden, die wir hier beschreiben, nützlich sowohl für die detaillierte Analyse von TGS in einem Entwicklungskontext, sondern auch in anderen Krankheitssituationen. Viele Gene , die in TGC Entwicklung und Funktion in Nagetieren beteiligt sind , zwischen Nagern und Menschen konserviert, wie Transkriptionsfaktoren, Proteasen und Zelladhäsionsmoleküle 21. Maus TGCs sind ein Zellmodell zur Untersuchung von Genen, die Entwicklung der Plazenta eine regulierend deshalb geben Einblicke in die menschliche Plazenta-Erkrankungen. Außerdem ist es aufgrund der Tatsache, dass diese Zellen endoreplicating und da einige Krebszellen endocycle Programme greifen, zusätzlich zur Genamplifikation Verfahren werden die Methoden, die wir beschreiben, sollten auch in Einzelzell Untersuchungen hilfreich sein erforderlich Mechanismen zu erforschen führende Instabilität in Krebszellen zu genom .
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sophie Gournet um Hilfe mit Abbildungen, Julie Chaumeil für das Manuskript zu lesen, um das Tier Gehäuse Anlage und die Imaging-Plattform des Gerätes. Diese Arbeit hat die Unterstützung im Rahmen des Programms «Investissements d'Avenir» erhielt von der Französisch Regierung ins Leben gerufen und umgesetzt von ANR mit den Referenzen ANR-10-LABX-0044 und ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, die EpiGeneSys FP7-Nr. 257082 Network of Excellence zu EH ein ERC Advanced Investigator Award Nr. 250367 und EU FP7 SYBOSS gewähren Nr. 242.129 EH Die Autoren möchten die Zell- und Gewebe Imaging Platform der Genetik und Entwicklungsbiologie Abteilung (UMR3215 / U934) des Institut Curie, Mitglied des Frankreich-Bioimaging (ANR-10-InSb-04) zu erkennen, für die Hilfe bei Licht Mikroskopie.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
References
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