Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em> En Vivo</em> Células trofoblásticas gigantes o<em> In Vitro</em> Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el cuidado de los animales institucional aprobado y el uso comité de los protocolos Instituto Curie (CEEA-IC) (C 75-05-18). El trabajo también se ha llevado a cabo bajo la aprobación del Ministerio de Educación Superior e Investigación de Francia para el uso de Organismos Genéticamente Modificados (número de contrato 5549CA-I). 1. Preparación de las secciones de criostato Recoger los embriones de ovular naturalmente F1 C57BL / 6 x DBA 2J ratones / como se describe en Shea et al., 12. En el día 7 de gestación (E7), sacrificar el ratón 8-12 semanas de edad mediante dislocación cervical. Recoger todo el producto de la concepción es decir decidua 12. Aislar conceptuses E7, como se describe en Shea et al., 12. Colocarlos en una placa de Petri de 60 mm que contenía PBS. Congelar el embrión de ratón E7 para las secciones de criostato. Preparar pozos de papel de aluminio adaptadas 1 cm de altura ( 'hecho en casa' usando una Pasteur de vidrio de pepitaet). Depositar una gota de medio de congelación de tejido en la parte inferior de este recipiente pequeño. Depositar el conceptus en la orientación correcta (es decir, para las secciones longitudinales del conceptus debe mantenido en su orientación horizontal). Llenar el pocillo que contiene el conceptus con el tejido medio de congelación. Suspenderlo con fórceps en vapor por encima de N2 líquido con el fin de permitir que se congele lentamente – luego sumerja el bloque en el líquido N2 durante unos pocos segundos hasta que se vuelve blanco. Posteriormente, transferir el bloque en un vial de congelación y se almacena a -80 ° C (se puede almacenar durante varios meses). Antes de crio-seccionamiento, colocar el bloque congelado que contiene el producto de la concepción a -20 ° C en el criostato durante 30 minutos. Realizar criosecciones de espesor 8 micras. Depósito 4 secciones en una diapositiva para permitir la unión eficiente. Se colocan los cortes lo suficientemente cerca como para caber debajo de un cubreobjetos de 18 x 18 mm 2. Comprobar la calidad de la(secciones intactas y sin arañazos) y la orientación del embrión (secciones longitudinales) con un microscopio estereoscópico y elegir las secciones adecuadas para su posterior análisis. Lo más rápidamente posible depositarlos en una jarra Coplin y realizar ARN FISH (Ver 3.3.2). 2. Preparación de TGC Secundaria Aislar el Conceptus (ver 1.1 y 1.2). Diseccionar el Ectoplacental Cono E7 (EPC) Utilizar un microscopio estereoscópico y cajas de Petri con PBS estéril. Diseccionar la decidua con unas pinzas. Pierce la muestra y fórceps abierto para despedazar los dos lados de la decidua aparte. Desembolsar el embrión. Usar puntas de unas pinzas finas cerradas (Dumont # 5) en una acción de tijera para separar el EPC del embrión propiamente dicho. Utilice especial cuidado para obtener una muestra perfectamente limpio, separado de tejido materno, así como de corion y el saco vitelino. Lavar la explantes EPC en PBS. Con un poco de cuchara, transferir EPC disecado individuo a un 4-well placa que contiene un cubreobjetos estéril en medio. TGC derivar de EPC Los cultivos a corto plazo. Preparar placas de 4 pocillos que contenían cubreobjetos. Esterilizar 12 mm de diámetro ronda cubreobjetos de vidrio por inmersión en etanol, seguido de la llama de secado. Añadir 0,5 ml de medio de EPC a cada pocillo (medio EPC: RPMI 1640 suplementado con 15% de FCS, 0,1 mM 2-mercaptoetanol y antibióticos). Único depósito, EPCs-disecados en el centro del cubreobjetos en el pozo junto con medio de cultivo. Utilice unas pinzas finas para aplicar el CPE sobre el portaobjetos de vidrio. Culturefor 3-5 días a 37 ° C, 5% de CO 2. Explante individual constituye una derivación que se extiende como una monocapa de TGC aplanado (Figura 2A). 3. ARN FISH NOTA: Los protocolos se basan en las descritas para las células madre embrionarias (CME) en Chaumeil et al, 8 y 13 Pollex y oído.. avanzada la AEEración de archivo Soluciones Preparar un tampón de acetato de sodio 3 M pH 5,2. Preparar tampón de hibridación 2x ​​que contiene un 40% (w / v) de sulfato de dextrano sódico, 20x BSA, 400 mM Vanadilo ribonucleósido Complejo (VRC) en 4x salina citrato de sodio (SSC). Preparar medio de montaje que contiene 90% (v / v) de glicerol, 0,1% (w / v) p-fenilendiamina, pH 9 en PBS. Soluciones recién preparadas Preparar la solución de fijación que consiste en paraformaldehído al 3% recién preparada (PFA) en PBS. Preparar la solución de permeabilización que contiene 0,5% de Triton-X-100 en PBS suplementado con 2 mM VRC. Preparar el tampón de lavado mediante la mezcla de 50% de formamida (FA) y 2x SSC y ajustar el pH a 7.2 a 7.4. Preparar la solución de contra-tinción de ADN que consiste en 1 mg DAPI / ml (4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol) en 2x SSC. La fijación y permeabilización de Preparación para FISH Para las células sobre cubreobjetos, lavar las células en 1 x PBS durante 5 men. Fijar las células sobre cubreobjetos, o secciones embrionarias en portaobjetos, por 10 min en fijador solución (3% PFA) a TA. Enjuagar las células tres veces con 1x PBS. Permeabilizar las células durante 5 min en solución de permeabilización enfriado en hielo en hielo. Lavar las células tres veces con 70% de etanol. cubreobjetos almacenar en placas de 4 pocillos y se desliza en caja de transporte 4-deslizante en el 70% de etanol a -20 ° C. NOTA: Los cubreobjetos y portaobjetos pueden almacenarse durante varios meses a -20 ° C. Placas y cajas que los contienen tienen que ser selladas con parafilm para evitar la evaporación del etanol. Etiquetado de ADN de la sonda Etiqueta de sondas de ADN por desplazamiento de la mella utilizando nucleótidos fluorescentes. Siga las instrucciones del fabricante (véase la Tabla 1) 8. Para una mezcla de reacción de 50 l, añadir 1-2 g de plásmido, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o la amplificación múltiple de desplazamiento (MDA) (para la amplificación del ADN; véase 3.4.4) de ADN a 17,5 l de agua, 2,5 l 0,2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 l de 10 mM de cada dNTP mix (dGTP, dATP, dCTP), dTTP 5 l 10 mM, 5 l de 10x tampón de traslación de corte y la enzima traslación de corte 8 l. Incubar durante 16 horas a 15 ° C en la oscuridad. Inactivar la reacción por congelación a -20 ° C. sondas para almacenaje de meses a -20 ° C. MDA NOTA: Para el ADN de BAC, la cantidad de ADN obtenido después de la preparación clásica es baja, por lo tanto, se puede usar una etapa de amplificación de ADN antes de su etiquetado mediante el uso de MDA. Utilice un kit comercial y seguir las instrucciones del fabricante (ver Tabla 1). Mezclar 0,5 l de ADN BAC con 9,5 l de tampón de muestra. Calentar 3 min a 95 ° C. Inmediatamente apagar en hielo; dejar en hielo 10 min. Prepare la mezcla de tampón de reacción / enzima: (9,5 l + 0,5 l de mezcla de enzimas) y mantener en hielo. Mezclar 10 l de mezcla de ADN + 10 l de mezcla de reacción tampón / enzima. Incubar a 30 ° C al menos 20 horas. Inactivar la enzima en la muestra de calentamiento 10 min a 65 & #176; C. muestra fresca a 4 ° C antes de almacenar a -20 ° C. Compruebe MDA mediante digestión. Añadir 1 l MDA, 2 l de 10x tampón, 2 l Hind III y 15 l de H2O Incubar a 37 ° C durante la noche. Ejecutar lentamente en un gel de agarosa al 0,8 hasta 1% para confirmar la amplificación de ADN exacta. Los fragmentos de ADN claras de alto peso molecular se deben observar en el gel. Preparación de la sonda Use 0,1 o 1 mg sonda por cubreobjetos o portaobjetos. NOTA: Añadir 2-5 g de ADN Cot-1 si se requiere la competencia, por ejemplo, la mayoría de las sondas, ya que pueden contener secuencias repetidas que se hibridan otra manera transversal e incrementar el fondo. Para la precipitación, se añaden 5 g de ADN de esperma de salmón, 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 3 volúmenes de etanol. Centrifugado a 16.000 x g y 4 ° C durante 25 minutos. Lavar gránulos con 70% de etanol y centrifugar de nuevo durante 5 min. gránulo seco durante 2 minutos en una aspiradora de concentrador / velocidad. Volver a suspender en forma 100%amida en la mitad del volumen requerido para la hibridación (por ejemplo, 2,5 l de cubreobjetos o 7 l para las secciones de embriones en la diapositiva). Coloca 30 min a 37 ° C con agitación en un Thermomixer. Desnaturalizar durante 7 minutos a 75 ° C. Saciar en hielo, o si competición tiene que poner directamente a 37 ° C durante 30-60 minutos. Mezclar la solución de la sonda con un volumen igual de solución de hibridación 2x. La hibridación y los lavados Deshidratar; cubreobjetos en los pozos, y se desliza en una jarra Coplin, por lavado secuencial en 1x 80%, 1x y 2x 95% etanol al 100% durante 5 minutos cada uno. cubreobjetos y portaobjetos secos completamente. Para la hibridación, aplicar el 5 l de mezcla de sonda de hibridación (véase 3.5) en un portaobjetos y bajar el cubreobjetos, con células que enfrenta en la mezcla de hibridación. Para las secciones de la diapositiva, aplique 14 l de mezcla de sondas de hibridación (véase 3.5) y cubrir con un cubreobjetos de 18 x 18 mm 2. Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda (papel de seda en remojo50% FA / 2x SSC) y se incuba a 37 ° C durante la noche, en la oscuridad. Los lavados post-hibridación: Añadir 1 ml de 50% FA / 2x SSC en el cubreobjetos sobre el portaobjetos para aflojarla; quitar el cubreobjetos con cuidado de la corredera (con cuidado de no raspar las células) y colocarla del lado celda hacia arriba en una placa de 4 pocillos que contiene 50% FA / 2x SSC. Para las secciones de la diapositiva, retirar el cubre de una manera similar y colocar la placa en un vaso de Coplin que contiene 50% FA / 2x SSC. Realizar 3 lavados, cada uno de 7 min con pre-calentado 50% FA / 2x SSC a 42 ° C o 44 ° C para cubreobjetos o diapositiva, respectivamente. Realizar 3 lavados con pre-calentado 2x SSC durante 5 min cada uno a 42 ° C o 44 ° C para cubreobjetos o diapositiva, respectivamente. Contratinción núcleos por lavado en 2x SSC con 1 g / ml DAPI durante 3 min a RT. Enjuague dos veces con 2 x SSC. Montaje del cubreobjetos y portaobjetos Para los pequeños cubreobjetos de TGC culta, aplique 5 y #181; medio de montaje sobre un portaobjetos l. Colocar la cubeta del lado del cubreobjetos hacia abajo en la parte superior de la gota. Para portaobjetos con las secciones, aplique 15 l medio en la diapositiva de montaje. Coloque una de 22 x 22 mm 2 cubreobjetos en la parte superior de la gota. Evitar las burbujas. Limpie el exceso de solución de montaje. Sellar el cubreobjetos con una pequeña cantidad de esmalte de uñas. Si es posible, la imagen se desliza inmediatamente o almacenar para un máximo de varios meses a -20 ° C. 4. Microscopía y análisis Adquirir imágenes en 3D del eje z secuenciales de 0,3 micras utilizando un microscopio de fluorescencia (objetivo 63X) y llevar a cabo el análisis de 3D ​​pilas de imágenes utilizando el software ImageJ 14.