Tıbbi Cihazlar Bakterilerin yüksek verimlilik Kimlik Savar Polimerler
Summary
A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Abstract
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Introduction
Polimer mikrodizileri kadar 7,000 polimerleri 1 prokaryotik veya ökaryotik hücreler, 2 paralel analiz için cam slaytlar üzerine yazdırılma yüksek verimlilik platformlar minyatür edilmiştir. Burada sunulan yöntem, ilk 2010 3'te tarif olanı üzerine kuruludur. Bu tarama sistemi, insan hepatositlerde 4, kök hücrelerin 5, renal tübüler epitel hücreleri 2, bakteriler 3,6 ve protozoon patojenler 7 de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri uygulanmıştır. Her iki durumda da, teşvik ya da üzerinde çalışılan hücre bağlanmasını dirençli polimerler, 8 tespit edilmiştir. Sentetik polikatyonik polimerler ile DNA kompleksleri de gene aday 9 yüksek verimli tarama mikrodizi biçiminde kullanılmaktadır. Yanı sıra hücre alt-tabaka etkileşim için tarama, polimerin mikrodizileri da malzeme özellikleri 10 değerlendirmek için kullanılmıştır.
">, Bir yüzeye bakteri bağlanmasını modüle etmek üzere sentetik polimerlerin özelliği de 3,6,11 kurulur. Keşfetmek biyo bakteriyel bağlama. Konvansiyonel yaklaşımlar etkilediği bilinmektedir yük, hidrofobiklik ve polimer yüzeyin yüzey pürüzlülüğü de dahil olmak üzere çok sayıda faktöre bu sırayla yoluyla bakteri bağlanması ya da ampirik olarak tasarlanması ve bir seferde bir malzeme test dirençli emek-yoğun, masraflı ve zaman alıcı işlemlerdir. Polimer mikroarray'ler bu tür sınırlamalar engellemeyi için cazip bir alternatif sunuyoruz.Karmaşık bir nüfus biyofilm olarak adlandırılan yüzey ilişkili bakteriler büyümek – Böyle biyofilm birçok çevresel streslere ve antibiyotiklere oldukça dirençlidir. Bu durum, 12 (proteinler, polisakkaritler, nükleik asitler oluşan) kendi yoğun hücre dışı matris ve kısmen biyofilm 13 sağlam "persistor" hücrelerinin artan varlığına kısmındadır. gerçi16 – ugh yüzey dernek ve sonraki biyofilm oluşumunun kesin mekanizmalar karakterize etmek zordur, genellikle yüzey büyüme 14 üç farklı aşama vardır olduğuna inanılmaktadır. Başlangıç, geri bağlantı hücrelerinin güçlü yapışması izlemektedir, hücre dışı bir protein üretimi ve polisakarit matrisi ve hücre proliferasyonu ile biyofilm kurulması. Son olarak, olgun biyofilm bültenleri yerde yeni enfeksiyonları başlatabilir planktonik hücreler, serbest yaşayan. Bakterilerin ilk eki önlemek ve dolayısıyla biyofilm oluşumunun erken aşamalarında önlemek polimerler bakteri kovucu, potansiyel enfeksiyonları en aza indirmek için mükemmel bir çözüm oluşturmaktadır. Antibiyotik direnci artışı göz önüne alındığında (ve aynı zamanda bir yüzey ile ilişkili bakterilerin 12 içsel daha direnci), enfeksiyonları azaltmak için antibiyotik içermeyen yollarla, özellikle ilgi konusudur. hastane ortamında, polimer bakteri kovucukaplamalar genellikle etrafında implante cihazlar 17 oluşturan hastane enfeksiyonlarının, azaltılması doğrudan tıbbi uygulama olabilir.
Burada, isabet doğrulama ve daha sonra kaplama ve santral kateter malzeme deneyi, ardından hastane enfeksiyonları ile ilgili patojenik bakterilerin bir dizi karşı itici bir aktivitesi için 381 polimerlerin taranması için yüksek verimli bir yöntem olup, (Şekil 1) tarif edilmektedir. Kısaca, polimerler, kurutma ve sterilizasyondan sonra, minyatürleştirilmiş diziler klinik olarak önemli bakteri kültürleri ile inkübe edildi, temasla baskı ile agaroz kaplı cam lam üzerine tespit edildi ve. İnkübasyondan sonra, mikrodiziler hafifçe yıkandı ve yapışan bakteri hücreleri, lekeli ve floresan ile görselleştirilmiştir. Daha sonra, bağlanma, bakteriyel inhibe polimerleri cam kapak slipleri üzerine kaplanarak daha geniş bir ölçekte incelendi ve elektron mikroskopi ile görüntülenmiştir. seçilen iterlerödünç polimerler daha sonra ticari bir kateter üzerine kaplanmış ve yaklaşık 100 kat bakteri yapışmasını azalttığı gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir yüzeye bakteri ataşman bakteri türlerinin göre, bir çok faktöre aralığı tarafından belirlenir karmaşık bir süreçtir, yüzey, çevreleyen aracı ve fiziksel çevre özellikleri. Belirli bazı kimyasal gruplarca bakteriyel bağlama etkilediği bilinmektedir, ancak zor spesifik işlevler için polimerlerin rasyonel tasarım, yapım kimyasal yapılara sahip polimerlerin biyolojik etkisini ilişkilendirerek, (poliglikoller, mesela, tipik olarak ek 11 karşı) zordur. Detaylı bağlanma mekanizmalarının yokluğunda, diğer çalışmalar uzun ve kapsamlı optimizasyon 21 süreçleri ile doğal olarak ortaya çıkan itici yüzeyler, taklit çalışmışlardır. Burada sunulan minyatür yüksek verimli yöntemi daha fazla çalışma için yol belirlemek için polimerlerin yüzlerce paralel tarama kolaylaştırarak bu zorlukların üstesinden gelir.
mikroarray yönteminin sonuçları esas ide hizmet. olasılıkla talebi adayları ntify Şekil 3, bağlama kapasitesi açık bir azalma gösterirken 2, en az bir türün, düşük bağlanma 22 aday göstermektedir Şekil. Şekil 2'de gösterilen tüm 22 düşük bağlayıcı polimerler (geçirmezlik ve kaplama özellikleri açısından) en iyi PU83, PA13 ve PA515 olarak saptanmıştır sırasında ölçek büyütme deneyleri, içine doğru çekilmiştir (Şekil 4 ve 5). Poliakrilatlar polimerizasyon yöntemleri açısından daha büyük bir esneklik sağlar ve bu düşük bağlayıcı poliakrilat, PA13, kateter kaplama çalışmaları için seçildi (Şekil 6 ve 7). Diğer adaylar üzerinde yapılacak daha detaylı çalışma yürütüldü ve başka bir yerde 6 bildirilmiştir.
Deneysel yineleme bir dizi sayesinde küçük adımlar bir dizi başarısı ve tekrarlanabilirlik anahtarı olduğunu gördük. Yanı sıra yapışmasını kolaylaştırmakAgaroz bakteri kolonizasyonu son derece dayanıklı olduğu gibi, temiz bir arka plan sağlar altında kaplama bir agaroz kullanılarak cam slaytlar polimerler. Aynı şekilde polimer içinde tutarlılık, aynı dizi içinde ve diziler arasında, hem kendilerini görür hayati ve bu nedenle dizilerin baskı dikkatle kontrol edilmesi gerekir. Baskı kafasına iğne ve 384 plaka da muntazam dolum dikkatli ayarlanması üniforma lekelenme sağlamak için gereklidir. Biz kullanılan polimerlerin bazı gibi bakteriler ile inkübasyon hayati önce her slayt için arka plan floresan verilerini alarak, otofloresansı bir ölçüde sergiledi. farklılıkları hesaba katmak için ve mikroarrayler sağlam veri çoğaltır tavsiye edilir elde etmek.
Burada kullanılan boya (DAPI) DNA'ya spesifik olmayan bağlanma bakteri türlerinin için bir seçiciliğe sahiptir. kirleticiler farkedilmeden gidebilir gibi bakteriyel kültürler tefsiratını kafa karıştırıcı, tanıtıldı Bu nedenle bir kez, iyi aseptik teknik esastırSonuçların lama. Aynı o çubuklar ve koklar ayırt ama cinsine veya tür değil sadece mümkün taramalı elektron mikroskobu kullanarak daha sonraki deneyler için de geçerlidir.
mikrotertip tarama sonra gelecek vaat eden polimerler, bundan başka doğrulama için seçilmelidir. Burada verilen örnekte, ilgi yedi polimerleri mikrodizisi üzerinde floresan kendi açık bir azalma ile tespit edilmiş ve bağlanma inhibisyon daha büyük yüzeyler üzerinde kaplanması ile teyit edilmiştir. Şekil 4 ve 5 ve cam lameller, bir ilgili elde edilen bağlanma azalma gösterir pratik araçlar toplu kaplamalar gibi ziyade mikroarray noktalar olarak polimerlerin davranışını test etmek. Daha sonra, bu polimerler, tam bakteri ek azalma ölçmek için tıbbi cihazlarda kaplanmıştır. Solvent (burada, kateter), bu kaplama çalışmaları için istenen alt tabakaya benign (protokol bakınız bölüm 8) muhafaza ederken seçilen önemlidirkaplama sağlamak için, ilgi konusu olan polimer çözümleme yetisine ing. Burada, bu özelliklere hem de düşük bir kaynama noktasına sahiptir ve tek bir kaplama bırakacak şekilde hızlı bir şekilde buharlaşır aseton kullanılır.
Belirli bir uygulama bağlı olacaktır seçilen doğrulama araçları çalışılmaktadır. Elektron ve floresan mikroskobu ile hücrelerin gözlem bireysel hücre eki direkt ölçümü sağlar, biz toplu boyama mikroarray tahlil bir tamamlayıcısı olarak bu teknikleri seçti. Sonuçlar ücretsiz doğrulama yöntemleri önemini göstermek, Şekil 6 ve 7'de gösterilmiştir. SEM burada pürüzsüz ve düzgün bir polimerin yüzeyinde bir değerlendirmesini sağlayan yararı vardır iken Şekil 6'da konfokal görüntüleri, bireysel hücrelerin çok net görüntü sağlar. Bu yöntemler, kullanılan Mikroskop görüş alanı ile sınırlıdır ve bu nedenle Importa arent sonuçlarına güven için anlık bir dizi çekmek için. Yukarıda tarif edilen yöntem, sadece küçük bölgelerde bir dizi kapsama sonucuna, tüm yüzey üzerinde bakteri yapışmasını nicelendirmek olamaz. Bu tarif edilen uygulama için yeterli olduğuna inanıyoruz. Bakteriyel bağlanma azalma başka bir yerde 22 açıklandığı gibi yöntemler kullanılarak, tüm kaplanmış ve kaplanmamış kateter parçaları yüzey yapıştırılır bakteri sayımı ile değerlendirilebilir. Ancak bu yöntemler, deneyler, genellikle karmaşık geometriye sahip tıbbi cihazlar ile gerçekleştirildiğinde korumak zor düzgün bir yüzey alanına sahip olması filtrelenmiş biyomalzeme yüzeyleri gerektirir.
Açıkçası, klinik kullanım için tasarlanmış herhangi bir cihaz, insanlarda güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için önemli daha fazla test geçmesi gerekiyor. Burada sunulan yöntem, in vivo aktivite onayı içermelidir bu süreç ve daha fazla çalışma başlangıcını temsil eder. Bu durumda, venöz okuyanatheters, ilk iş kan bileşenleri ve polimer bütün hücrelerin bağlanmasını araştırmak olabilir. Bakteriyel bağlama kan bileşenlerinin etkisi muhtemelen etkinleştirilmiş serum veya de-fibrinated kan 23 varlığında bağlanma tahlilleri tekrarlayarak, dikkate alınmalıdır. Teknoloji kesin testi gibi deri altından implant enfeksiyon modeli 24 gibi bir in vivo modelde olur.
Biz yüzey değiştiren polimerlerin elenmesi için polimer mikroarray yönteminin potansiyelini göstermektedir. Bu gibi polimerler, (her ikisi de mukavemet ve bağlayıcı bakteri üremesini teşvik), bu yöntem, yani araştırma birçok alanda yararlı olabilir, ilaç, gıda sanayi ve biyoteknoloji uygulamalarında çok sayıda vardır. burada çalışma bakterileri kullanmasına rağmen, yöntem, diğer hücre tipleri ve aynı şekilde diğer kimyasal mikrodizileri adapte edilebilir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Materials
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -. F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).
- Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. . Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, (2000).
- Kuo, J. . Electron microscopy methods and protocols. , (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
