의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머
Summary
A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Abstract
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Introduction
고분자 마이크로 어레이는 최대 7,000 폴리머 (1) 원핵 또는 진핵 세포 2 병렬 분석을 위해 유리 슬라이드에 인쇄하는 높은 처리량 플랫폼을 소형화하고 있습니다. 여기에 제시된 방법은 우리가 처음 2010 3에 기술 된 것을 바탕으로.이 검사 시스템은 인간의 간세포 4, 줄기 세포 5, 신 세뇨관 상피 세포 2, 박테리아 3,6 및 원생 동물 병원균 (7) 등 다양한 세포 유형에 적용되었습니다. 각각의 경우에, 촉진 또는 연구중인 세포의 결합을 레지스트 중합체 8을 확인 하였다. 합성 다양 이온 중합체와 DNA의 복합체는 유전자 형질 전환 후보 (9)의 하이 스루풋 스크리닝하기위한 마이크로 어레이 형태로 사용되어왔다. 뿐만 아니라, 세포 기질 상호 작용에 대한 스크리닝으로, 중합체 마이크로 어레이는 재료의 특성 (10)을 평가하기 위해 사용되었다.
"> 표면에 박테리아의 부착을 조절하는 합성 중합체의 능력은 잘 3,6,11 설립된다. 발견 생체 재료의 박테리아 결합. 종래의 방법에 영향을 미치는 것으로 공지되어 전하, 소수성 고분자 표면의 표면 거칠기 등 다양한 요인 즉, 순차적으로 박테리아의 결합 또는 실험적 설계 및 한번에 하나의 재료를 테스트 레지스트 노동 집약적이고 비용이 많이 들고 시간 소모적 인 프로세스이다. 폴리머 마이크로 어레이는 이러한 한계를 회피에 대한 매력적인 대안을 제공한다.복잡한 인구는 바이오 필름을 지칭로 표면 관련된 박테리아 성장 – 같은 바이오 필름이 많은 환경 스트레스와 항생제에 높은 내성. 이는도 12 (단백질, 다당류 및 핵산으로 구성된)들이 고밀도 세포 외 기질에 부분적으로 기인 생물막 13 강력한 "persistor"세포의 증가의 존재에 부분적으로있다. Altho16 – 우 표면 연관 이후 바이오 필름 형성의 정확한 메커니즘을 특성화하기 어려운, 일반적으로 성장 표면 (14)의 세 가지 단계가 있다고 생각된다. 초기 가역 첨부 세포 강한 접착 뒤에, 세포 외 단백질의 생산 및 다당류 매트릭스 및 세포 증식에 의한 바이오 필름의 확립. 마지막으로, 성숙한 생물막 릴리스는 다른 새로운 감염을 시작할 수 있습니다 플랑크톤 세포를 자유롭게 살고. 박테리아의 초기 부착을 방지하고, 따라서 생물막 형성의 초기 단계를 방지 폴리머 세균이 격퇴, 잠재적으로 감염을 최소화하기위한 우수한 솔루션을 나타냅니다. 항생제 내성의 상승을 감안 (및 관련 박테리아 표면 (12)의 본질적으로 큰 저항), 감염을 감소 항생제가없는 수단은 특히 중요하다. 병원 환경에서, 중합체를 박테리아는 격퇴코팅은 일반적으로 주위에 이식 장치 (17)를 형성 원내 감염의 감소에 직접적인 의료 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다.
여기서, 히트 검증 및 후속 코팅 및 중앙 정맥 카테터 재료의 분석에 선행 원내 감염과 관련된 병원균의 범위에 대해 반발 활동 381 중합체의 스크리닝을위한 높은 처리량의 방법은 (도 1)를 설명한다. 간략하게, 중합체는 건조 및 살균 한 후, 소형화 배열은 임상 적으로 중요한 세균 배양으로 배양, 연락처를 인쇄하여 아가 로스 코팅 된 유리 슬라이드에 발견 하였다. 배양 한 후, 마이크로 어레이를 부드럽게 세척하고 부착 세균 세포는 형광 염색에 의해 가시화 하였다. 이어서, 결합 세균 억제 중합체는 유리 커버 슬립 위에 코팅하여 대규모로 조사하여 전자 현미경에 의해 가시화 하였다. 선정 반발빌려준 중합체는 상업적 카테터 상에 도포하고, 거의 100 배의 박테리아 부착을 감소시키기 위해 도시되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표면에 세균이 부착 세균 종에 의존하는 다양한 요소에 의해 결정되는 복잡한 공정이며, 표면 주변 매체 및 물리적 환경의 특성. 특정 화학 그룹이 세균 결합 영향을주는 것으로 알려져 있지만 도전 특정 기능을 위해 중합체의 합리적인 설계를 만드는 화학적 구조를 갖는 중합체의 생물학적 영향을 상관 (폴리 글리콜을, 예를 들면, 일반적으로 부착 11 레지스트) 어렵다. 상세한 부착 메커니즘이없는 경우, 다른 연구는 길고 광범위한 최적화 21 프로세스 자연 발생 발수 표면을 모방하기 위해 시도했다. 여기에 제시된 소형 높은 처리량 방법은 연구를 위해 리드를 식별하는 폴리머의 수백의 병렬 검사를 용이하게하여 이러한 문제를 극복한다.
마이크로 어레이 방법의 결과는 주로 IDE하는 역할을. 가능성이 리드 후보를 ntify 그림 3은 용량 결합의 명확한 감소를 보여줍니다 동안 2, 적어도 하나의 종의 낮은 바인딩 22 후보를 보여줍니다. 그림 2에 표시된 모든 22 낮은 결합 중합체는 (반발 및 코팅 특성의 관점에서) 가장이 PU83, PA13 및 PA515로 결정했다 동안 스케일 업 실험에 앞으로 데려 가게되었다 (그림 4, 5). 폴리 아크릴 레이트는 중합 방법의 관점에서 유연성을 제공하며, 따라서 낮은 결합 폴리 아크릴 레이트, PA13은 카테터 코팅 연구를 위해 선택 하였다 (도 6 및도 7). 다른 후보에 대한 자세한 추가 작업을 실시하고, 다른 곳에서 6보고되었다.
실험의 반복 수를 통해 우리는 작은 단계의 수는 성공과 재현성의 핵심이었다 발견했다. 뿐만 아니라의 부착을 용이아가로 오스는 세균성 식민지에 대한 높은 내성으로, 깨끗 한 배경을 제공에서 코팅 아가로 오스를 사용하여 유리 슬라이드에 폴리머,. 마찬가지로, 중합체의 일관성은 동일한 배열 내에서 어레이 사이 모두 자신 스폿 중요하고, 따라서 어레이의 인쇄가 심하게 제어되어야한다. 상기 인쇄 헤드 핀과 384 웰 플레이트의 또한 균일 한 충전의주의 깊은 조정이 균일 안보를 보장하기 위해 필요합니다. 우리가 사용하는 폴리머의 일부로서 세균 배양이 중요되기 전에 각 슬라이드 배경 형광 데이터를 가지고, 자기 형광의 정도를 나타내었다. 변동을 고려하고 마이크로 어레이의 강력한 데이터 복제가 좋습니다 얻었다.
여기에 사용 된 염색 (DAPI)는 DNA에 비 특이 적으로 결합 박테리아 종에 대한 선택성이 없습니다. 오염 물질이 들키지 수 있으므로 세균 문화가 interpre 혼란 도입되면 따라서, 좋은 무균 기술이 필수적이다결과 테이션. 동일한는 봉과 구균 구별하지만 속에 또는 종하지 만 가능 주사 전자 현미경을 사용하여 나중에 실험 사실이다.
마이크로 어레이 검사 후, 유망 중합체는 더 확인을 위해 선택해야합니다. 여기에 제시된 실시 예에서, 관심 일곱 중합체 마이크로 어레이에 형광 그들의 명확한 감소에 의해 식별하고, 부착 그 억제는 큰 표면을 코팅하여 확인 하였다. 4 및도 5는 커버 글라스, A의 달성 결합의 감소를 보여 실용적인 수단은 대량 코팅 등이 아닌 마이크로 어레이 명소와 폴리머의 동작을 테스트합니다. 그 후,이 폴리머는 완전히 세균 부착 감소를 정량화하는 의료 기기에 코팅 하였다. 용매 (여기 카테터)이 코팅 연구에 원하는 기판에 양성 (프로토콜 8 항 참조) 유지하면서 선택하는 것이 중요합니다코팅을 허용하기 위해, 관심있는 중합체를 용해하는 능력을 보내고. 여기에서는, 속성 언급뿐만 아니라, 낮은 비점을 갖는 균일 한 코팅을 남겨 빠르게 증발 아세톤을 사용 하였다.
특정 응용 프로그램에 따라 다릅니다 선택한 검증의 수단이 연구되고. 전자와 형광 현미경으로 세포를 관찰 개별 세포 부착을 직접 정량화 할 수 있습니다, 우리는 대량 염색 마이크로 어레이 분석에 대한 보완이 기술을 선택했다. 결과는 무료 검증 방법의 중요성을 입증도 6 및도 7에 표시됩니다. 주사 전자 현미경 여기에 부드럽고 균일 한 고분자의 표면의 평가를 허용하는 추가 혜택을 가지고있는 동안 그림 6의 공 촛점 이미지는 개별 세포의 매우 선명한 이미지를 제공합니다. 이러한 방법에 사용되는 현미경의 시야가 제한하고, 그러므로 importa되어있다NT는 결과에 대한 확신을 가지고 일련의 스냅 샷을 촬영합니다. 상기 한 방법은 단지 소 영역의 번호로부터 유추 따르면, 전면 박테리아 부착을 정량화 할 수 없습니다. 우리는이 기술 응용 프로그램에 대한 충분하다 생각합니다. 세균 결합의 감소는 다른 22 바와 같은 방법을 사용하여 전체에 코팅 된 코팅 카테터 편에 표면 부착 박테리아를 열거하여 평가 될 수있다. 그러나 이러한 방법은 분석은 종종 복잡한 형상을 의료 기기로 수행 될 때 유지하기가 어렵다 균일 한 표면 영역을 갖도록 선별 바이오 물질의 표면을 필요로한다.
분명히, 임상 사용하기위한 모든 장치는 인간의 안전성과 유효성을 보장하기 위해 상당한 추가 테스트를 통과해야합니다. 여기에 제시된 방법은 생체 내 활성의 확인을 포함해야이 과정과 향후 작업의 시작을 나타냅니다. 이 경우, 정맥 C 공부atheters 초기 연구는 혈액 성분과 중합체 전체 세포의 결합을 조사 할 수있다. 세균 결합 혈액 성분의 효과는 아마도 비활성화 혈청 디 fibrinated 혈액 (23)의 존재하에 결합 분석을 반복하여, 고려되어야한다. 기술의 최종 테스트는 피하 이식 감염 모델 (24)로 생체 내 모델에있을 것입니다.
우리는 표면 변질 중합체의 스크리닝 중합체 마이크로 어레이에있어서의 전위를 보여준다. 이러한 중합체는 (모두 저항과 결합 세균을 촉진)이 방법을 의미하는 것은 연구의 많은 분야에서 유용 할 수 있습니다, 의학, 식품 산업 및 생명 공학에 응용 프로그램의 큰 숫자가 있습니다. 일이있어 박테리아를 사용하지만,이 방법은 다른 유형의 세포와 마찬가지로 화학 마이크로 어레이에 적용 할 수있다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Materials
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
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