전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
조혈는 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)가 같은 대동맥 – 생식소 – Mesonephros로 배아 조혈 사이트와 태반 1,2의 다양한 존재 hemogenic 내피 세포를 싹 복잡한 발달 과정이다. 체외에서 배양 조혈 모세포에 대한 무능력이 과정의 깊이 분석뿐만 아니라 이러한 연구의 임상 응용 프로그램을 방지 할 수 있습니다. 이 제한을 회피하기 위해, 기존의 연구는 유도하기 위해 시도 조혈 모세포 드 노보 중 재 프로그래밍 미디어 4,5를 사용하는 다 능성 줄기 세포 (PSC를) 3, 또는 체세포에서 유도 소성 감독 분화의 차별화를 통해. 이 연구는, 그러나, 임상 적으로 안전 engraftable 세포를 생성하거나 결정적인 발달 조혈의 연구를 허용하지 않습니다 "접시를."
체세포 섬유 아세포의 페이지에서 야마나카 연구팀에 의해 설립 된 신규 작업을 유도 생성하는 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)전사 인자 (TF) 프로그래밍 세포 운명 6,7에 기반 과발현 전략을위한 프레임 워크를 rovides. 이 작품은 쉽게 얻을 체세포의 TF의 재 프로그래밍을 통해 선택의 세포 유형을 생성하기 위해 여러 분야의 연구자를 묻는 메시지가있다. 여기에 설명 된 프로그래밍 전략 목표는 마우스 체세포 시험 관내에서 인간 조혈을 연구하기 위해 환자 별 섬유 아세포를 재 프로그램 할 수있는 인간의 시스템에 이들 결과를 변환하는 목표와 TF 기반 프로그래밍 방법을 사용하여 세포로부터 hemogenic 처리를 유도하는 것이다 질병 모델 약물 테스트에 대한 환자 – 특정 혈액 제제를 생성하고, 줄기 세포 이식.
이러한 마우스 시스템의 적절한 프로그래밍을 위해 첫 번째 단계는 CD34 발현 내피 전구 세포 및 조혈의 공지 된 마커에 대한 판독 역임 리포터 라인을 개발 하였다. 이렇게하려면 huCD34-TTA와 TETO-H2BGFP 유전자 변형 마우스 라인 g을 사용 하였다enerate 이중 형질 전환 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs에)는, 이제 CD34 발기인 (8)의 활성화에 따라 녹색 형광 34 / H2BGFP를 나타낸다. 이는 조혈 명세서 및 개발하는 동안 다른 지점에서 요구되는 공지의 TF의 다양한 스크리닝시켰다. PMX retrovial 벡터 18과 TF를 시작으로 34 / H2BGFP MEFs에는 AFT024 기질 세포를 HSC는지지의 모든 요소 배양과 형질 도입 된, (34 / H2BGFP 마우스를 설명 문학 마이닝 및 이전에서 조혈 모세포를 유지 GFP 라벨의 프로파일 링을 통해 결정). 기자의 활성화를위한 TF가 최적의 설정이 확인 될 때까지 34 / H2BGFP 활성화의 검출 후, TF가이 연속적으로 재 프로그래밍 칵테일에서 제거되었습니다. 이 초기 화면 후에 인자하여 TFS의 발현을 제어 할 수 있도록하는 유도 DOX pFUW 벡터 시스템으로 옮겼다. 이 두 DOX 제어 시스템 (34 / H2BGFP 세포와 pFUW 유도 벡터)에서 MEFs에 호환되지 않는 때문에야생형 C57BL / 6 마우스가 필요했다. hemogenesis 진행하고 multilineage 클론 원성 전구 세포를 만들 수 있도록 적절한 미세 환경을 제공하는 것도 필요했다.
조혈 줄기 및 전구 세포로 (HSPCs)에 체세포를 재 프로그래밍을 시도하는 현재의 연구는 성공 9-11의 다양한 수준을 만났다. 현재까지, 마우스 및 장기 자기 갱신 다시 채우기 능력이 인간의 이식 가능한 HSPCs 모두의 발생과 TF들의 동일한 세트를 사용하여 달성되어 있지 않다. 이 프로토콜에서는 재현 된 MEFs에서 hemogenesis을 유도하는 미리 설정된 전략에 대한 상세한 설명을 제공한다. 우리는 TF가 (Gata2, Gfi1b, cFos를, 그리고 Etv6)의 최소한의 도입을 보여 발달 조혈 및 조혈 프로그래밍의 임상 응용 프로그램이 더 (12)를 연구 할 수있는 플랫폼을 제공 체외에서 복잡한 개발 프로그램을 선동 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
쉽게 달성 체세포에서 HSPCs 새로이 생성하는 것은 잠재적으로 시험관 내에서 조혈 및 기회를 연구 인간 시스템에이 기술을 적용하는 독특한 방법을 제공한다. 이 번역은 접시에 인간의 혈액 질환을 연구뿐만 아니라 새로운 치료제 또는 HSC 이식 수많은 장애를 치료 할 수있는 기회를 대상으로 약물 테스트 플랫폼과 유전자를 제공하기 위해 새로운 도구를 생성합니다. 필드에서, 최근?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
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