Ekstraksiyon ve Topraklarda Mikrobiyal Fosfolipid Yağ Asitleri Analizi

NOT: Her zaman o uygun kişisel koruyucu donanımlar (KKD) sağlamak protokol boyunca giyilir. Züccaciye çıplak elle dokunulmaması gerekir. parmaklar, saç, gres, yağlar ve hidrokarbonlar gelen lipidler tüm potansiyel kirletici maddelerdir. Temiz cam işleme her zaman% 70 alkol ile nitril eldiven ve durulama eldiven giyin. Analiz için Züccaciye 1. Hazırlık Tek kullanımlık kaplar (örneğin, santrifüj tüpleri) 450 ° C'de dört buçuk saat mufl ocağında alüminyum folyo ve ısı sarın. Politetrafloroetilen (PTFE) kapakları -lined fosfat deterjan içinde bir saat boyunca kapaklar ıslatın ve daha sonra sıcak su ve fosfat deterjan tahta fırçası ile yıkayın. musluk suyu ile sabun durulayın. Sadece (uzun gömlekleri onlar çok uzun süre ıslatılır eğer kapaklar düşebilir olarak bırakmayın. Üç kez durulayın asit banyosuna yerleştirin bir saat (% 5 HCl)musluk suyu ile. damıtılmış suda üç kere yıkayın. 40 ºC fırında kurutun. Cam eşyalar (örneğin, 10 mi, 15 mi, 45 mi küçük şişeler / kavanoz) sıcak su ve fosfat deterjan fırçalama fırça ile yıkayın. asit banyosuna (% 5 HCl) gecede musluk suyu ve yer ile sabun durulayın. daha sonra 40 ° C'de bir fırında üç damıtılmış su içinde süreleri ve daha sonra kuru durulayın, musluk suyu içinde üç kez yıkayın. Temiz alüminyum folyo ile sarın (50 ml kavanoz ayrı sarılır ve diğer cam numune gruplar halinde sarılır, örneğin, 20) ve 450 ºC'de dört buçuk saat mufl ocağında ısı. Hacimsel cam (örneğin, ölçülü balona) sıcak su ve fosfat deterjan fırçalama fırça ile yıkayın. asit banyosuna (% 5 HCl) gecede musluk suyu ve yer ile sabun durulayın. Musluk suyu ile üç kez yıkayın damıtılmış suda üç kere yıkayın ve 40 fırında sonra kuru# 186; C. Mufl ocağında hacim cam koyun değil – çözücünün küçük bir miktarının (örneğin, metanol) 3 kez yıkayın Kullanımdan önce. Önce PLFA Analizine 2. Toplama ve Toprak Örneklerinin İşleme Steril torbalara toprak örnekleri toplamak ve bu hemen analiz edilebilir sürece, en kısa sürede onları dondurmak. hazır olana kadar dondurucuda (-80 ºC) saklayın örnekleri örneklerin dondurarak kurutma işlemine devam etmek için. dondurarak kurutma talimatları izleyerek numunelerin kuru toplu dondurun. Yeni etiketli steril torbanın her bir dondurularak kurutulmuş örnek aktarın. PLFA çıkarılması için önceden işaretlenmiş örtülü santrifüj tüpüne torbaya dondurularak kurutulmuş malzeme numune tartılır. NOT: Genel bir kural organik maddeler (karbon içeriği>% 17 wt) ve mineral toprak örnekleri için 3.0 g 0,5 g kullanmaktır. Her numune için kayıt örneği ağırlığı. Her 10 numune için, aynı zamanda bir tarttınanalizi için, her 20 örnek için ek çift bulunmaktadır, bir boşluk (yani, herhangi bir örnek olmayan bir santrifüj tüpü – PLFA çıkarma işlemi sırasında herhangi bir potansiyel kontaminasyonu belirlemek için bir kontrol olarak kullanılmıştır). Aynı zamanda numune tüpleri Süreci toplu. Not: 20 numune kümesi 23 numune tüpleri bir toplu karşılık gelir (numune 1 ila 10, örnek 10 bir çift numuneler 12 ila 22, örnek 22 bir çift ve 23 örnek tüplerinin boş bir = kesikli). NOT: GC analizi için onları hazırlamak ve bunları birbirine çalıştırmadan önce numunelerin toplu daha sonra çıkarma, ayrılık, metilasyon yürütün. Bu bir şey yanlış giderse hatalar olmuş nerede belirlemek ve gerekli tekrar ekstraksiyon sayısını düşürmeye yardımcı olabilir yardımcı olur. 3. PLFA Tekniği (adımlar bir defada bireysel numune ama tam bir bütün parti içindir) NOT: Adımlar açıklanan PLFA tekniğinin tüm adımlar1-3 aşağıdaki uygun PPE kullanarak ve laboratuvar güvenlik yönergeleri izleyerek bir davlumbaz yapılmalıdır. Ekstraksiyon (Aşama 1): 50 ml damıtılmış KOH 14 g deiyonize su (dH 2 O) çözülmesiyle 5.0 M KOH hazırlayın. DH 2 O 400 ml 31.52 g sitrik asit çözülmesiyle 0.15 M sitrat tamponu hazırlayın 5.0 M KOH eklenerek pH 4.00 ± 0.02 ayarlayın; Yaklaşık 5.0 M KOH 45-50 mi 4.00 pH'ın ayarlanması için gerekli olacaktır. pH ayarlı olduğunda, volümetrik bir şişe kullanılarak 1.000 ml sitrat tamponu seyreltilir. kullanılmadığı (en fazla bir ay) buzdolabında sitrat tampon saklayın. (Bu 23 numune grubu için yeterli yedek bir standart sağlar), 25 mL kloroform içinde stok çözeltisi (10 mg / ml) 250 ul seyreltilmesiyle nonadecanoate taşıyıcı günlük standart PC (0: 0/19 19) hazırlayın. PC 0.5 ml ekleyin (19: 0/19: 0) örnek santrifüj tüpüne vekil standart çözüm. biraşağıdaki sırayla toprak numunesine Bligh ve Dyer özütleyici dd: i) 2.0 mL sitrat tampon, ii) 2.5 ml kloroform ve iii) 5.0 ml metanol. 30 saniye boyunca bir PTFE kaplı kapak ve vorteks ile kapak örneği; 2 saat için son aşırı uç çalkalayıcısına konulmaktadır. kapağı ile 15 dakika boyunca 226 x g'de santrifüjleyin. etiketlenmiş bir 45 ml'lik bir cam şişeye, bir Pasteur pipeti ile transfer süpernatant çizin. Her bir örnek için Bligh ve Dyer özümleme ikinci tur ekleyin ve yukarıdaki adımları 4 ve 5 tekrarlayın. Aynı etiketli 45 ml bir cam şişeye, bir Pasteur pipeti ile transfer süpernatant çizin. etiketli 45 ml bir cam şişe ihtiva eden yüzer ekleyin: i) 5.0 ml kloroform ve ii) 5.0 mL sitrat tampon maddesi. Beyaz PTFE kaplı kapak ve vorteks cam kapak 30 saniye boyunca şişesine yerleştirilir. Bu (oksidasyon) önlemek için karanlıkta, oda sıcaklığında bir gece bekletin. Dikkatle 45 ml'lik bir şişeye, üst sulu faz (vakum mevcut ise, pipet mikrolitre ile düşürülmelidir rahatsız vakumorganik faz pipetlerken zaman çok dikkatli olarak lı faz) pipet herhangi toplamak değil. etiketli 15 ml şişe içine Pipet alt organik faz. Oda sıcaklığında sıkıştırılmış N2 (Oksidasyondan kaçınmak için) altında, 15 ml lik cam şişelere yeri parti. Şişede sıvının yüzey fırfır ama şişenin yanlarını tırmanmaya için N2 akışı ayarlama kapalı yavaş kloroform buharlaştırın. -20 ° C'de derin dondurucuda PTFE kaplı kapak ve mağaza örnekleri üzerinde vida ºC 2. Adım ile devam hazır olana kadar alüminyum folyo (tek tek gruplar yerine de şal) 'de tamamladı. Lipid fraksiyon (Aşama 2) Cam deposundaki musluk ile SPE kolon tutucu yerleştirin. musluk yeni SPE sütunu (silika, 500 mg, 6 mi) yerleştirin. Gerekirse etiket sütunları (örnekler karıştırma önlemek için önerilir). (5 ml aseton ekleyerek ve süzülmesini izin vererek, her bir sütun durumu, ve daha sonra 5 ml kloroform, iki eklenen yazıToplam hacim = 10 ml). İkinci kloroform yıkama 1 ~ kadar mm frit üzerinde dışarı akmasına ve sonra tertibatı kapatmak için izin verin. hafifçe şişe ve vorteks 0.5 mi kloroform ilave edilerek (Kademe 1 sonunda 15 ml'lik bir şişeye, saklanan) örnek yeniden çözülür. Transfer Pasteur pipeti kullanılarak SPE kolonuna örnek yeniden çözündürüldü; 2 transferlerin toplam (örnek başına 1 ml kloroform toplam transfer hacmi) için tekrarlayın. sütunun merkezine doğrudan lipit örnek Lay ve tankın içine tamamen boşalmasını çözücü bekleyin. Her bir sütun 5 ml kloroform ilave edilerek nötr lipidler Zehir. tanka tamamen boşalmasını çözücü izin verin. Her bir sütun, 5 ml aseton ekleyerek glikolipitler Zehir. toplama tankına tamamen boşalmasını çözücü izin verin. Sütun tankından durmak ve vakum cihazı ile deposunu boşaltmak çıkarın. tanka temiz ve etiketli santrifüj tüplerine ile raf yerleştirin. Sütun tankı üzerinde durmak değiştirin; etiketli sütun üzerinde işaretlenmiş centr ile aynı hizada olmalıdırAşağıdaki ifuge tüp. Her bir sütun, 5 ml metanol eklenerek santrifüj tüplerine fosfolipidleri Zehir. Bunlardan atmadan önce davlumbaz kuruması SPE sütunlar için bekleyin. Sıkıştırılmış N2 altında oda sıcaklığında kuru aşağı fosfolipid fraksiyonları. -20 ° C'de derin dondurucuda PTFE kaplı kapak ve mağaza örnekleri üzerinde N 2. Vida ile tasfiye tüpler 3. Adıma devam etmek için hazır olana kadar alüminyum folyo (tek tek gruplar yerine de şal) 'de tamamladı. Lipid metilasyonu (Aşama 3). 37 ºC olarak ayarlanmış sıcak su banyosu açın. 1000 ml hacimli bir şişeye kullanılarak 1.000 mi dH 2 O 57.1 ml buzlu asetik asit çözülmesiyle (yapmış ise) 1 M asetik asit hazırlanması. Bu çözelti, bir ila üç ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. . metanolik KOH toplu hazırlayın. 40 ml metanol içindeki bir 0.45 g KOH çözülmesiyle 0.2 M KOH çözeltisi hazırlayın. Bir göre KOH hacmi ve metanol ayarlamaAdım 3. günde bu çözüm hazırlayın içinde nticipated parti büyüklüğü; uzun bir süre için muhafaza etmeyin. dondurucu (Kademe 2 de sonra saklanan santrifüj tüplerine) örnekleri çıkarın ve numuneler oda sıcaklığına gelmeye bırakın. 1.0 mi, metanolik KOH ile, ardından 0.5 mi kloroform ve her bir örnek için, 0.5 ml metanol ilave edin. Cap tüpleri sıkıca PTFE kaplı bir kapakla. karıştırmak için girdap. 30 dakika 37 ° C banyo mühürlü numuneler. Su seviyesi Örnek sıvının seviyesinden 1-2 mm minimum olduğundan emin olun. Çıkarın ve numuneler soğumasını bekleyin. Numuneler bir su banyosunda olsa da, örnek kimliği (PTFE kaplı bir kapakla 10 ml'lik bir cam şişe) küçük bir cam şişe etiket. Her bir numune ve girdap 2.0 mi heksan ekleyin. Daha sonra her bir numune tekrar karıştırmak için girdap 1.0 M asetik asit, 0.2 ml ekleyin; faz ayrılması görünür hale gelmelidir. Fazının bozulması için her bir örnek dH 2 O 2.0 ml ilave edilir. 30 saniye vorteksleyin örnekleri. 2 dakika boyunca 226 x g'de santrifüj sonra örnekler. kullanmakısa Pasteur pipet, üst faz 10 ml şişeleri etiketli edilerek temizlenmesinde aktarın. düşük (sulu) faz herhangi aktarmak için dikkatli olun. Her bir numune, bir santrifüj tüpüne ve girdap 2.0 mi heksan ekleyin. 30 saniye vorteksleyin örnekleri. 2 dakika boyunca 226 x g'de santrifüj sonra örnekler. Kısa bir Pasteur pipeti kullanılarak yeniden etiketli 10 ml bir cam şişeye En faz ekleyin. N2 altında oda sıcaklığında etiketli-10 ml bir cam şişe içinde solvent buharlaşır. -20 ° C'de derin dondurucuda PTFE kaplı kapak ve mağaza örnekleri üzerinde vida ºC GC analizi ile devam etmeye hazır kadar alüminyum folyo (tek tek gruplar yerine de şal) 'de tamamladı. Tüm örnekler etiket emin olun. Gaz kromatografisi (GC) analizi NOT: Her PLFAs tanımlanması ve miktar, bir FID ya MS detektörü ya da bağlı bir GC kullanılarak gerçekleştirilir. Aşağıdaki talimatlar GC-FID için ise, numune hazırlama GC-MS için geçerli olacak well. İlk sıcaklığı 285 ºC 190 ºC, rampa 10 ºC / dak: GC-FID sistemi için örnek bir set-up 0.33 mikron (% 5 -fenil) × -methylpolysiloxane aşağıdaki sıcaklık protokolü ile sütun 0,2 mm × 25 m yer alacak rampa 60 310 ºC ºC / dak, 0.42 min 31 tutun, 9.5 dakika tutun. MeC10 bir damla ekleyerek GC iç standart (ISTD) hazırlayın: 100 ml hekzan 0 (metil dekanoat) (kayıt, 0.1 mg ağırlık ekledi). GC gazların açın ve daha sonra GC açın. H 2, N 2 ve hava tüpleri açık ve analiz çalıştırmak için yeterli gaz olduğunu emin olun (H 2 500 psi altında olsun asla). İyi bir kalibrasyon koşullar hekzan boş ardından yağ asitlerinin bir karışımı içeren kalibrasyon standartları çalıştırarak karşılandığını kontrol edin. Bireysel yağ asitlerinin Kimlik el standartları için elde tutma süreleri ile karşılaştırmalar dayalı atanabilir veya bu automatica olabilirLly piyasada mevcut yazılımları 31 kullanılarak atanır. Her durumda, şüphe götürmez teşhisini MS detektörü 2 kullanılarak elde edilebilir. NOT: İyi bir kalibrasyon Ek belirtiler düz bir dayanak ve hekzan durulama hiçbir kontaminasyon içerir. Örnek yanıt, çok gibi zayıf olduğu tahmin edilmektedir, alternatif olarak 50 ila 75 ul kullanımı (ISTD solüsyonundan 150 ul (lipit metilasyon Kademe 3 10 ml bir cam şişe içinde yer alan), her bir PLFA Örnek artığı içinde çözündürülür ve GC şişe içine aktarmak kumlu topraklarda). 2 ul numune enjeksiyon hacmi ayarlayın. 300 ºC FID sıcaklığını ayarlamak. Taşıyıcı gaz (akış oranı 1.3 mL / dakika) ve 30 'lik bir ayırma oranı olarak H2 ile, 250 ° C arasında bir giriş sıcaklığı kullanılarak örnekleri çalıştırın: 1.