הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

T תאים להבדיל באמצעות סדרה של ביניים התפתחותיים התימוס במהלכן הם נתקלים בכמה מחסומים המבטיחים בדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי ^1-3. סלקציה חיובית מקדמת את ההישרדות של thymocytes עם קולטנים של תאי T (TCR) מסוגלים להכיר, עם נמוך הזיקה מתונה, פפטיד שהציגו מולקולות מורכבות histocompatibility גדולות (MHC) על תאי אפיתל הרתי קליפת מוח (cTEC) ^2,3. סלקציה שלילית ו- T רגולטוריים התפתחות התא (T _reg) לתרום להקמת סובלנות עצמית באמצעות חיסול או הסטת thymocytes שמגיבים בחריפות-פפטיד עצמי שהציג MHC ^2,4. בשלה CD4 ⁺ CD8 ⁺ חיובית כפולה (DP) thymocytes להביע TCRs שעוברים תהליך הבחירה להתמיין תת-אוכלוסיות של תאי T בוגרים, שרובם הם מהשורה MHC-מוגבל ואני ציטוטוקסיות CD8 ⁺או בכיתת MHC II-מוגבל CD4 ⁺ עזר יחיד חיובי (SP) ותאי T, לפני היציאה התימוס כדי לבצע פעולות מפעיל באיברים הלימפה משני ^1-3.

מה שמוסיף למורכבות של פיתוח תאי T, ההגירה הדינמית ומפגשים הסלולר לפתח thymocytes ברחבי רשת תא סטרומה ^5-9. בתאי סטרומה אלה ממלאים תפקידים ברורים בפיתוח thymocyte ומופצים באופן דיפרנציאלי בין האזורים קורטיקליים מדולריים הרתי שבו חיובי סלקציה שלילית להתרחש ^10. למרות סלקציה חיובית מתרחשת בעיקר בקליפת המוח, יש ראיות מצטבר thymocytes העקור נודד אל הלשד ולהמשיך לדרוש אותות TCR לפני שהם להתמיין לתאי T בוגרים דבר המצביעים על כך הלשד עשוי לספק אותות נוספים הדרושים להשלמת מבחר חיובי שושלת בידול ^11,12. נוסף,למרות נוכחותם של תאי אפיתל הרתי מדולרי מיוחדים (Mtec) מבטאים ו אנטיגנים הנוכחי מוגבל רקמות הקלת מחיקה של thymocytes אוטוריאקטיבים ^13,14, חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בקליפה בתגובה הביע בכל מקום בגוף-פפטיד עצמי שהציג הדנדריטים תאים ^15,16. לפיכך, מודלים מדויקים של פיתוח תאי T חייב לספק microenvironment הרתי מאורגן, עם קליפת המוח ללא פגע ואזורים מדולרי, המאפשר אינטראקציה בין thymocytes ותאי סטרומה, ותומך הגירה thymocyte כמו תאים אלה עוברים סלקציה חיובית ושלילית.

כדי להשלים vivo לשעבר מנתח של thymocytes כאמצעי לימוד מבחר חיובי ושלילי, מספר במבחנה, באתרו, ו במודלי vivo של התפתחות תאי T פותח ^17-22. זה כבר ידוע לשמצה קשה לשחזרבחירה במבחנה חיובית, אבל coculture של אוכלוסיות תא גזע או מבשרי תא T עם תאי סטרומה להביע ליגנד Notch, בעיקר OP9-DL1 / 4 תאים, יש לו את היכולת לתמוך במחויבות שושלת T ו סלקציה חיובית מוגבלת מה שהופך אותו לא יסולא בפז במודל חוץ גופייה כדי מחקר תאי T פיתוח ^23-25. מגבלות של מערכת זו, עם זאת, כוללים את העובדה כי תאים אלה חסרים את מכונות עיבוד פפטיד ייחודי המצוי בתאי סטרומה הרתי ואת microenvironment הרתי תלת ממדי.

למרות שלמעלה טכנית מסורבלת, באתרו במודלים vivo של מבחר הרתי יכול להתגבר על מחסומים הקשורים למערכות במבחנה. תרבויות איבר Reaggregate הרתי (RTOC) מכילים מוגדר תערובות של thymocytes ותאי סטרומה הרתי ^18,26,27. reaggregates תא אפיתל הרתי אלה לשמור הביטוי שהייתי בכיתה MHC ו- II והוא יכול לתמוך developmeNT של שני תת התא הקונבנציונלי T, אך עדיין חסרת מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים. תרבות איבר הרתי עוברית (FTOC) היא מודל פופולרי של פיתוח תאי T שניתן זורע עם thymocytes באמצעות תרבות תליית טיפת אונות הרתי lymphodepleted או באמצעות זריקה של thymocytes לתוך lymphoreplete אונות הרתי ולתמוך בפיתוח יעיל של CD4 ⁺ ו- CD8 ⁺ T תאים לאורך זמן בתרבות ^18,28-31. ב החניכה של התרבות של אונות הרתי העובר יש מחסור של mTECs, אך מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים עלולים לפתח לאורך זמן בהתאם לתנאים. שיקול חשוב הוא כי מודל זה עשוי לתמוך עוברי מועדף לעומת פיתוח תא הבוגר T. לבסוף, הזרקת intrathymic של מבשרי הרתי מוגדר בעכברים בוגרים הוא מאתגר מבחינה טכנית אך ברור מספקת סביבה לתמיכה פיתוח תאי T in vivo. אלו באתרו במודלים vivo הם לא כלים מצויניםo מחקר T תא הפיתוח והשימוש שלהם צריך להיחשב על בסיס ניסוי אחר ניסוי.

פרוסות הרתי, לעומת זאת, צמחו לאחרונה כמודל צדדי, משלים ללמוד בחירה הרתי באתרו עם האפשרות להכיל ייחודי, מורכב, ובדרך כלל ניסויי תפוקה גבוהים יותר. פרוסות הרתי לשמור על השלמות של האזורים קורטיקליים מדולריים ולספק מסגרת של תאי סטרומה שתומכת גירת thymocyte במהלך פיתוח, כמו גם מבחר חיובי ושלילי יעיל ^11,32-39. תת thymocyte הוסיף גבי פרוסות הרתי נודדים לתוך רקמות נישת microenvironmental המתאימה שלהם ^34,37. Thymocytes המעולף ניתן להבחין בין תאי אנדוגני פרוסה הרתי באמצעות סמני congenic או תוויות ניאון והוא יכול להישמר בתרבות במשך כמה ימים. תרבויות organotypic פרוסה הרתי יכול לשמש כדי לחקור היבטים שוניםההתפתחות של תאי T כולל מבחר הרתי, התנהגות thymocyte (הגירה אינטראקציות הסלולר), ולוקליזציה thymocyte, בין היתר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר, את יכולת ההרחבה של ניסויים היא בדרך כלל גדולה יותר מאשר אחרים במודלים באתרו של מבחר הרתי. למרות הכנת פרוסות הרתי דורשת ציוד מיוחד, כגון vibratome, ואת זמן החיים של פרוסות הרתי בתרבות מוגבלת בשל אובדן של תאים לאורך זמן באמצעות מוות של תאים וחוסר קרום encapsulating, פרוסות הרתי לספק מודל מצוין לניתוח של מבחר הרתי של אוכלוסיות מסונכרנות של thymocytes בתוך microenvironment הרתי בוגר. כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי (כולל קצירת התימוס, הטבעת agarose של אונות התימוס vibratome חתך של הרקמות המוטבעות), בידוד שכיסה של thymocytes, הניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח התזרים cytometric.