Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

T – Zellen differenzieren durch eine Reihe von Entwicklungs Intermediate in den Thymus während welcher Zeit sie mehrere Prüfpunkte auftreten, die die Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerant T – Zell – Repertoire ^1-3 gewährleisten. Positive Selektion fördert das Überleben von Thymozyten mit T – Zell – Rezeptoren (TCR) in der Lage zu erkennen, mit geringer bis moderater Affinität, Peptid durch Haupthistokompatibilitätskomplex – Moleküle (MHC) auf die kortikale Thymusepithelzellen (cTEC) ^2,3 dargestellt. Negative Selektion und regulatorischen T (T _reg) Zellentwicklung trägt zur Schaffung der Selbsttoleranz über die Eliminierung oder Abzweigung von Thymozyten , die stark auf Selbst Peptid reagieren presented by MHC ^2,4. Unreife CD4 ⁺ CD8 ⁺ doppelt positiven (DP) Thymozyten TCRs exprimieren, die den Auswahlprozess unterscheiden sich zu reifen T – Zell – Subpopulationen, die meisten davon sind MHC – Klasse – I-restringierte CD8 ⁺ zytotoxische passierenoder MHC – Klasse – II-restringierten CD4 ⁺ Helfer einzigen positiven (SP) T – Zellen, bevor die Thymusdrüse austretenden Effektor – Funktionen in den sekundären lymphatischen Organen ^1-3 auszuführen.

Zusätzlich zu der Komplexität der T – Zell – Entwicklung ist die dynamische Migration und zelluläre Begegnungen von Thymozyten ganzen Stromazellen Netzwerk ^5-9 entwickeln. Diese Stromazellen spielen verschiedene Rollen in Thymozyten Entwicklung und zwischen den Thymus kortikalen und medullären Regionen unterschiedlich verteilt , in denen positive und negative Selektion ¹⁰ auftreten. Obwohl positive Selektion in erster Linie in der Rinde nimmt, gibt es vermehrt Hinweise, dass DP Thymozyten zur Medulla migrieren und weiterhin TCR-Signale zu verlangen, bevor sie sich zu reifen T-Zellen differenzieren was darauf hindeutet, dass die Medulla notwendig, zusätzliche Signale für die Fertigstellung der positiven Selektion und Abstammung liefern kann Differenzierung ^11,12. Des Weiteren,Erleichtern Deletion autoreaktiver Thymozyten ^13,14 trotz der Anwesenheit von spezialisierten Mark Thymus – Epithelzellen (mTEC) , die und Gegenwart gewebe beschränkt Antigene exprimieren, ein großer Teil der negativen Selektion auftritt in der Hirnrinde in Reaktion auf ubiquitär exprimierten Selbst Peptid präsentiert von dendritischen Zellen ^15,16. So müssen genaue Modelle der T-Zell-Entwicklung stellen eine äußerst Thymus Mikro organisiert, mit intakter Rinde und Mark Regionen, die die Interaktion zwischen Thymozyten und Stromazellen erleichtert und unterstützt thymocyte Migration, da diese Zellen positive und negative Selektion unterzogen werden.

Zur Ergänzung der ex vivo – Analysen von Thymozyten als Mittel zum Studium positive und negative Selektion, eine Reihe von in vitro, in situ und in vivo Modelle der T – Zellentwicklung wurden ^17-22 entwickelt. Es war notorisch schwierig zu rekapitulierenpositive Selektion in vitro, aber Co – Kultur von Stammzellpopulationen oder T – Zell – Vorläufer mit Stromazellen Notch – Liganden exprimieren, insbesondere OP9-DL1 / 4 – Zellen, hat die Fähigkeit , T – Linie Engagement und begrenzte positive Selektion macht es einen unschätzbaren de – vitro – Modell zu unterstützen, Studie T – Zell – Entwicklung ^23-25. Einschränkungen dieses Systems gehören jedoch die Tatsache, dass diese Zellen die einzigartige Peptid Maschinen für die Verarbeitung fehlt in Thymus-Stroma-Zellen und die dreidimensionale Thymus-Mikroumgebung gefunden.

Obwohl technisch umständlich, in situ und de – vivo – Modellen von Thymus – Auswahl einige der Barrieren in Bezug auf de – vitro – Systemen zu überwinden. Reaggregieren Thymus – Organkulturen (RTOC) enthalten Mischungen von Thymozyten und Thymus – Stroma – Zellen ^18,26,27 definiert. Diese Thymus-Epithelzellen-reaggregates halten MHC-Klasse-I und II-Expression und developme unterstützennt beider herkömmlichen Zelluntergruppen T, aber immer noch kortikalen und medullären Strukturen nicht ausreichend definiert. Fötalem Thymus – Organkultur (FTOC) ist ein beliebtes Modell der T – Zell – Entwicklung , die mit Thymozyten über hanging-drop Kultur lymphodepleted Thymus Lappen oder durch Injektion von Thymozyten in lymphoreplete thymic Keulen und unterstützen effiziente Entwicklung von CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T ausgesät werden können Zellen im Laufe der Zeit in Kultur ^18,28-31. Bei Beginn der Kultur von fötalen Thymus Lappen gibt es einen Mangel von mTEZ, aber definierten kortikalen und medullären Strukturen können im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Bedingungen zu entwickeln. Eine wichtige Überlegung ist, dass dieses Modell bevorzugt im Vergleich zu Erwachsenen-T-Zell-Entwicklung fötalen unterstützen. Schließlich ist intrathymischen Injektion von definierten Thymus-Vorstufen in erwachsenen Mäusen technisch anspruchsvoll, aber stellt klar, eine Umgebung zu unterstützen T – Zell – Entwicklung in vivo. Diese in situ und de – vivo – Modelle sind hervorragende Werkzeuge to Studie T-Zell-Entwicklung und ihre Verwendung sollte an einem Experiment-by-Experiment Basis betrachtet werden.

Thymus – Scheiben haben sich jedoch heraus kürzlich als vielseitiges, komplementärer Modell thymic Auswahl in situ mit der Möglichkeit zu untersuchen einzigartig, komplex aufzunehmen, und in der Regel einen höheren Durchsatz Experimenten. Thymus – Scheiben , die Integrität der kortikalen und medullären Regionen zu erhalten und einen Rahmen von Stromazellen bereitzustellen , die Thymozyten Migration während der Entwicklung sowie effiziente positive und negative Selektion ^11,32-39 unterstützt. Thymocyte Subsets oben auf Thymus – Scheiben wandern in das Gewebe und in die entsprechenden Mikroumgebungs Nische ^34,37 hinzugefügt. Das überlagerte Thymozyten aus Thymus-slice endogene Zellen über kongenen Marker oder Fluoreszenzmarkierungen unterschieden werden und kann in Kultur für mehrere Tage aufrechterhalten werden. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen können verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu studierenvon T-Zell-Entwicklung, einschließlich Thymus-Selektion, Thymozyten Verhalten (Migration und zellulären Wechselwirkungen) und Thymocyten-Lokalisierung, unter anderem. In Anbetracht der Fähigkeit ~ 20 Thymus – Scheiben zu erzeugen pro Maus, ist die Skalierbarkeit von Experimenten im Allgemeinen größer als andere in situ Modelle von Thymus – Auswahl. Obwohl die Herstellung von Thymus slices spezialisierte Ausrüstung erfordert, wie dem Vibratom und die Lebensdauer der Thymus-Scheiben in Kultur begrenzt ist, zu einem Verlust von Zellen im Laufe der Zeit über den Zelltod aufgrund und das Fehlen einer einkapselnden Membran bereitzustellen thymic Scheiben ein ausgezeichnetes Modell zur Analyse von Thymus Auswahl von synchronisierten Populationen von Thymozyten innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Herstellung von Thymus-Scheiben (einschließlich Ernten des Thymus, Agarose Einbettung von Thymus Lappen und Vibratom Schnitte des eingebetteten Gewebe), Isolation und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die Durchflusszytometrie-Analyse.