Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.
Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a ‘Ca2+ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.
Een verandering van de intracellulaire Ca2 + concentratie ei (eicel) activering is een geconserveerd deel van alle onderzochte organismen 1,2. Deze gebeurtenis start uiteenlopende Ca2 + -afhankelijke processen, waaronder de hervatting van de celcyclus en translatie van mRNAs opgeslagen. Door deze eis voor Ca2 + visualiseert de voorbijgaande veranderingen in de intracellulaire Ca2 + concentratie is van essentieel belang.
Historisch gezien werden modelorganismen geselecteerd studies over eieren activatie gebaseerd op de grootte en de beschikbaarheid van eieren. Verschillende visualisatie benaderingen zijn gebruikt om veranderingen te volgen en kwantificeren intracellulaire Ca2 + concentraties in deze systemen, inclusief: het fotoproteïne aequorine in medaka vis 3; Ca 2+ gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals Fura-2 in zee-egels en hamster 4,5; en calcium groen-1-dextran in Xenopus 6.
Het genereren en verbetering van genetisch gecodeerd calcium indicatoren (Geçiş) heeft de mogelijkheid om te visualiseren Ca 2+ dynamiek in vivo 7 omgezet. Deze genetische constructen uitgedrukt in specifieke weefsels en beperken de noodzaak voor invasieve weefselpreparaten 8.
GCaMPs een groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde klasse Geçiş die zeer effectief zijn vanwege hun hoge Ca2 + affiniteit, signaal-ruisverhouding en capaciteit worden aangepast 9-11. In de aanwezigheid van Ca2 +, de GCaMP complex ondergaat een reeks conformationele veranderingen, te beginnen met de binding van Ca2 + aan calmoduline, wat leidt tot een toegenomen fluorescentie-intensiteit van het GFP component 9.
GCaMPs zijn uitgebreid gebruikt in onderzoek Drosophila neuronen veranderingen in intracellulaire calcium 12 visualiseren. De recente applicatiop van GCaMP technologie om Ca 2+ te visualiseren in de volwassen Drosophila eieren is gebleken dat één van voorbijgaande aard Ca 2+ golf bij ei activering 13,14. De Ca 2+ golf kan worden gevisualiseerd op lage vergroting tijdens de ovulatie in vivo 13 of bij een hogere vergroting met behulp van een ex vivo activering assay 13,14. In de ex vivo analyse worden afzonderlijke rijpe oöcyten geïsoleerd van de eierstokken en geactiveerd door een hypotone oplossing, genoemd activeringsbuffer, waarvan is aangetoond dat de gebeurtenissen van in vivo activering 15-17 recapituleren.
Deze ex vivo test maakt een eenvoudige hoge resolutie visualisatie van de Ca 2+ golf onder verschillende experimentele condities waaronder farmacologische verstoring, fysieke manipulaties en genetische mutanten. In dit artikel wordt de voorbereiding van de volwassen Drosophila eieren voor ex vivo activering en the daaropvolgende microscopie gebruikt om de Ca 2+ wave met behulp van GCaMP visualiseren. Deze benadering kan worden gebruikt voor de initiatie en controle van de Ca2 + golf testen en resultaten downstream probe.
The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar voor Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya voor hulp tijdens de voorbereiding van dit manuscript; Mariana Wolfner voor discussies op ei activering; Matt Wayland voor imaging-ondersteuning; en Nan Hu algemene steun in het laboratorium.
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Cambridge, ISSF om TTW [subsidie nummer 097.814].
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80mm x 25mm |