Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Los monocitos son células inmunes innatas que se pueden activar por patógenos y la inflamación asociados con ciertas enfermedades inflamatorias crónicas. La activación de monocitos induce funciones efectoras y un cambio concomitante de oxidativo con el metabolismo glicolítico que se acompaña de aumento de la expresión del transportador de glucosa. Este aumento del metabolismo glicolítico se observa también para la inmunidad entrenado de los monocitos, una forma de memoria inmunológica innata. Aunque se han descrito los protocolos in vitro que examinan la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa por los monocitos, ninguno ha sido examinado por el flujo multi-paramétrico citometría en la sangre entera. Se describe un protocolo de citometría de flujo multiparamétrica para la medición de la absorción de glucosa análogo 2-NBDG fluorescente en sangre entera por los monocitos totales y la clásica (CD14 ++ CD16 -), intermedio (CD14 ++ CD16 +) y no clásica ( CD14 + CD16 ++) monocitossubpoblaciones. Este método se puede utilizar para examinar la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa para los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos durante la homeostasis y la enfermedad inflamatoria, y se puede modificar fácilmente para examinar la captación de glucosa para otros leucocitos y subpoblaciones de leucocitos en la sangre.
Introduction
Los monocitos son un componente importante del sistema inmunitario innato humano que se movilizó rápidamente a los sitios de infección e inflamación 1. La activación de los monocitos es crítico para limitar los daños por patógenos aguda y también es central en la patogénesis de varias enfermedades crónicas, incluyendo la aterosclerosis 2, cáncer de 3, y el VIH 4,5.
El metabolismo de reposo y monocitos activados difiere drásticamente, con monocitos en reposo que utilizan el metabolismo oxidativo y monocitos activados que utilizan el metabolismo glucolítico (es decir, la fermentación de la glucosa a lactato) 6. La activación de los monocitos induce la expresión de los transportadores de glucosa que permite un aumento de la captación de glucosa para el metabolismo glucolítico 7. glucosa monocitos transportador 1 (Glut1) es uno de esos transportador upregulated durante la activación y su expresión se ha demostrado que conducen a la producción de citoquinas pro-inflamatorias en vitro y en el tejido adiposo de ratones obesos 8. La infección de una línea celular de monocitos por el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi conduce a la regulación positiva celular de Glut1 9, y recientemente hemos demostrado que durante la infección crónica por el VIH un aumento del porcentaje de monocitos que expresan GLUT1 están presentes durante la infección terapia antirretroviral tratados y sin tratar 10 de combinación. Tomados en conjunto, estos estudios demuestran que la captación de glucosa y el metabolismo glicolítico por los monocitos son aspectos importantes de muchas enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, un método simple para medir la expresión Glut1 de monocitos y la captación de glucosa durante la homeostasis y la enfermedad inflamatoria es probable que sea de utilidad para una amplia gama de investigadores.
Los monocitos humanos son heterogéneos, que se compone de tres subconjuntos distintos que se pueden examinar por la expresión diferencial de la CD14 y marcadores de superficie celular CD16 11,12. monocitos clásicas expresan un alto nivel de CD14 pero no expresan CD16 (CD14 CD16 ++ -), monocitos intermedios expresan un alto nivel de CD14 y un nivel intermedio de CD16 (CD14 ++ CD16 +), y no clásica monocitos expresan un bajo nivel de CD14 y un alto nivel de CD16 (CD14 + CD16 ++). Los monocitos que expresan CD16 se denominan monocitos CD16 +, que compararon a CD16 – monocitos tienen una alta expresión de citoquinas inflamatorias y la capacidad de forma más efectiva presentan antígenos 13,14. Aproximadamente el 10% de los monocitos expresan CD16 durante homeostasis con porcentajes más altos observados durante la inflamación 15. Subpoblaciones de monocitos están asociados con ciertos estados de enfermedad y podrían ser marcadores biológicos útiles de progresión de la enfermedad y la enfermedad 16.
Nuestro objetivo era identificar un método que puede medir la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa por los monocitos humanos y subpoblaciones de monocitos en condiciones lo más cercanas a phycondiciones siological como sea posible. Estudios anteriores miden la expresión del transportador de glucosa de monocitos y la captación de glucosa 17,18, aunque estos métodos examinados monocitos aislados que pueden haber alterado la expresión de proteínas en comparación con las condiciones fisiológicas 19, y ningún estudio previo ha examinado las subpoblaciones de monocitos humanos. El uso de flujo multi-paramétrico citometría, se describe un método para examinar la expresión del transportador de glucosa y la absorción del análogo de la glucosa fluorescente 2-NBDG por los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos (basado en CD14 y la expresión de CD16) dentro de la sangre no manipulada conjunto.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí detalla un método simple para examinar la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa análogo fluorescente por monocitos y monocitos subpoblaciones en la sangre entera. Mediante la evaluación de la captación de 2-NBDG en sangre entera, esta técnica permite condiciones similares a las in vivo. Un estudio anterior examinó 6-NBDG captación en monocitos resultantes de la separación por centrifugación de densidad 17. Sin embargo, este estudio no …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el Centro Australiano para el VIH y la hepatitis Virología Investigación (ACH 2) y una subvención del desarrollo 2010 (CNIHR) de la Universidad de Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programa financiado por el NIH con el número premio AI027757 que se apoya por el siguiente NIH Institutos y Centros (NIAID, NCI, NIMH, el NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP es un receptor de la subvención 2 CNIHR y ACH. SMC es un receptor de un Salud y medicina Consejo Nacional de Investigación de Australia (NHMRC) Principal beca de investigación. Los autores agradecen la contribución a este trabajo del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa Victorian recibida por el Instituto Burnet. Reconocemos la ayuda de Geza Paukovic y Eva Orlowski-Oliver de la Facilidad AMREP Citometría de Flujo Core para citometría de flujo capacitación y asesoría técnica. Agradecemos a Angus Morgan para el entrenamiento y la organización de la sesión de vídeo medios de comunicación. nuestro agradecimientoa Jesse Masson y Jehad Abdulaziz K. Alzahrani para la asistencia de laboratorio durante la filmación del video. Damos las gracias a los esfuerzos del Dr. David Simar de la Facultad de Ciencias Médicas, UNSW, Australia que ofrecieron asesoramiento metodológico crítico. CSP quisiera agradecer www.nice-consultants.com de consultas gráficas.
CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES:
CSP concibió el proyecto, diseñó y llevó a cabo experimentos, analizado e interpretado los datos, y escribió el manuscrito. JJA interpreta los datos y escribió el manuscrito. TRB escribió el manuscrito. JMM interpretado los datos, hizo sugerencias intelectuales críticos, y revisó el manuscrito. SMC interpretado los datos, hizo sugerencias intelectuales críticos y revisó el manuscrito.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
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