Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
I monociti sono cellule immunitarie innate che possono essere attivati da agenti patogeni e l'infiammazione associata con alcune malattie infiammatorie croniche. L'attivazione dei monociti induce funzioni effettrici e uno spostamento concomitante da ossidativo al metabolismo glicolitico che è accompagnato da un aumento dell'espressione trasportatore del glucosio. Questo aumento del metabolismo glicolitico si osserva anche per l'immunità qualificato di monociti, una forma di memoria immunologica innata. Anche se sono stati descritti in vitro protocolli de esame espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento di glucosio da parte dei monociti, nessuno è stato esaminato dal flusso multiparametrica citometria nel sangue intero. Descriviamo un multi-parametrica protocollo citometria di flusso per la misurazione della fluorescenza analogico glucosio 2-NBDG assorbimento nel sangue intero dal totale monociti e classico (CD14 ++ CD16 -), intermedio (CD14 ++ CD16 +) e non classica ( CD14 + CD16 ++) monocitisottopopolazioni. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento di glucosio per un totale di monociti e sottopopolazioni monociti durante l'omeostasi e la malattia infiammatoria, e può essere facilmente modificato per esaminare l'assorbimento del glucosio per altri leucociti e sottopopolazioni di leucociti all'interno del sangue.
Introduction
I monociti sono una componente importante del sistema immunitario innato umano, che stanno rapidamente mobilitato per siti di infezione e infiammazione 1. L'attivazione dei monociti è fondamentale per limitare i danni acuti da patogeni ed è anche fondamentale per la patogenesi di diverse malattie croniche, tra cui l'aterosclerosi 2, il cancro 3, e l'HIV 4,5.
Il metabolismo di riposo e monociti attivati differisce notevolmente, con monociti riposo che utilizzano il metabolismo ossidativo e monociti attivati utilizzando il metabolismo glicolitico (vale a dire, la fermentazione del glucosio in lattato) 6. L'attivazione dei monociti induce l'espressione di trasportatori del glucosio che permette di aumentare l'assorbimento del glucosio per il metabolismo glicolitico 7. Monociti trasportatore di glucosio 1 (Glut1) è un tale trasportatore upregulated durante l'attivazione e la sua espressione è dimostrato di portare alla produzione di citochine pro-infiammatorie in vItro e nel tessuto adiposo dei topi obesi 8. L'infezione di una linea cellulare monocitica da sarcoma di Kaposi associato herpesvirus porta ad upregulation cellulare di Glut1 9, e abbiamo recentemente dimostrato che durante l'infezione cronica da HIV una maggiore percentuale di monociti GLUT1 esprimenti sono presenti durante antiretrovirale un'infezione non trattata e terapia di combinazione trattati 10. Presi insieme, questi studi dimostrano che l'assorbimento di glucosio e il metabolismo glicolitico da monociti sono aspetti importanti di molte malattie infiammatorie. Così, un metodo semplice per misurare l'espressione Glut1 monociti e l'assorbimento del glucosio durante l'omeostasi e la malattia infiammatoria è probabile che sia di utilità per una vasta gamma di ricercatori.
Monociti umani sono eterogenei, essendo composto da tre sottoinsiemi distinti che possono essere esaminati da espressione differenziale di marcatori di superficie delle cellule CD14 e CD16 11,12. monociti classici esprimono un elevato livello di CD14, ma non esprimono CD16 (CD14 ++ CD16 -), monociti intermedie esprimono un elevato livello di CD14 e un livello intermedio di CD16 (CD14 ++ CD16 +), e non classica monociti esprimono un basso livello di CD14 e un alto livello di CD16 (CD14 + CD16 ++). I monociti che esprimono CD16 sono chiamati CD16 + monociti, che rispetto al CD16 – monociti hanno alta espressione di citochine infiammatorie e la capacità di più efficace antigeni presenti 13,14. Circa il 10% dei monociti esprimono CD16 durante l'omeostasi con percentuali più elevate osservate durante l'infiammazione 15. Sottopopolazioni monociti sono associati a determinate patologie e potrebbero essere utili marcatori biologici della malattia e della progressione della malattia 16.
Il nostro obiettivo era quello di individuare un metodo in grado di misurare l'espressione del trasportatore del glucosio e l'assorbimento di glucosio da monociti umani e sottopopolazioni monociti in condizioni come vicino a PHYcondizioni siological possibili. Studi precedenti misurati espressione del trasportatore del glucosio e dei monociti assorbimento del glucosio 17,18, anche se questi metodi esaminati monociti isolati che possono aver alterato l'espressione della proteina rispetto alle condizioni fisiologiche di 19, e nessun precedente studio ha esaminato sottopopolazioni monociti umani. Utilizzando flusso multiparametrica citometria, si descrive un metodo per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento del glucosio analogico fluorescente 2-NBDG dal totale monociti e sottopopolazioni monociti (sulla base di CD14 e CD16 espressione) all'interno di sangue intero non manipolata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui DETTAGLI un metodo semplice per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e fluorescenti glucosio assorbimento analogico da monociti e monociti sottopopolazioni di sangue intero. Valutando 2-NBDG assorbimento nel sangue intero, questa tecnica consente di condizioni simili a quelle in vivo. Un precedente studio ha esaminato 6-NBDG assorbimento nei monociti separati dal sangue intero dalla densità centrifugazione 17. Tuttavia, questo studio non ha esaminato sott…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal Centro australiano per l'HIV e l'epatite Virologia Ricerca (ACH 2) e una borsa di studio di sviluppo 2010 (CNIHR) presso l'Università di Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programma finanziato NIH con il numero premio AI027757 che è supportato dalla seguente NIH Istituti e Centri (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP è un destinatario del 2 concessione CNIHR e ACH. SMC è destinatario di un Salute e Medical Research Council Nazionale di Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. Gli autori ringraziano il contributo a questo lavoro del Vittoriano programma di infrastrutture di supporto operativo ricevuto dall'Istituto Burnet. Riconosciamo l'assistenza di Geza Paukovic ed Eva Orlowski-Oliver dal Fondo Amrep Citometria a flusso di base per citometria a flusso formazione e consulenza tecnica. Ringraziamo Angus Morgan per gli allenamenti e l'organizzazione del video riprese dei media. La nostra gratitudineJesse Masson e Jehad Abdulaziz K. Alzahrani per l'assistenza di laboratorio durante le riprese video. Ringraziamo gli sforzi del dottor David Simar presso la Scuola di Scienze Mediche, UNSW, l'Australia che ha offerto consulenza critica metodologica. CSP ringrazia www.nice-consultants.com per consultazioni grafiche.
CONTRIBUTO AUTORI:
CSP ha concepito il progetto, ideato e condotto esperimenti, analizzato e interpretato i dati, e scrisse il manoscritto. JJA interpretato i dati e ha scritto il manoscritto. TRB ha scritto il manoscritto. JMM ha interpretato i dati, ci ha dato consigli intellettuali critici e recensione del manoscritto. SMC ha interpretato i dati, ci ha dato consigli intellettuali critici e recensione del manoscritto.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
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