Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
מונוציטים הם תאי מולדת חיסון מסוגלים להיות מופעלים על ידי פתוגנים דלקת הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות מסוימות. הפעלת מונוציטים גורמת פונקציות מפעילות ומעבר במקביל מ חמצוני מטבוליזם glycolytic המלווה ביטוי נשא גלוקוז מוגברת. מטבוליזם glycolytic מוגברת זו נצפתה גם עבור חסינות מאומן של מונוציטים, סוג של זיכרון אימונולוגי מולד. למרות פרוטוקולים במבחנה בבדיקת ביטוי גלוקוז טרנספורטר ספיגת הגלוקוז על ידי מונוציטים תוארו, אף אחד מהם לא נבדקו על ידי זרימת רב פרמטריים cytometry בדם כולו. אנו מתארים פרוטוקול התזרים cytometric רב-פרמטרים למדידת הספיגה אנלוגי גלוקוז ניאון 2-NBDG בדם כולו על ידי מונוציטים הכולל לבין (CD16 CD14 ++ -) הקלסי, ביניים (CD14 ++ CD16 +) ו הלא קלסי ( CD14 + CD16 ++) מונוציטיםתת-אוכלוסיות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון ביטוי נשא גלוקוז ספיגת הגלוקוז עבור מונוציטים הכולל תת-אוכלוסיות מונוציטים במהלך הומאוסטזיס ומחלות דלקתיות, וניתן לשנות בקלות לבחון ספיגת הגלוקוז עבור לויקוציטים אחרים תת-אוכלוסיות לויקוציטים בתוך הדם.
Introduction
המונוציטים מהווים מרכיב עיקרי של המערכת האנושית המולד החיסונית כי מגויס במהירות לאתרים של זיהום ודלקת 1. הפעלת מונוציטים הוא קריטי עבור הגבלת נזק אקוטי ידי פתוגנים מרכזי גם בפתוגנזה של מחלות כרוניות שונות, כולל טרשת עורקים 2, סרטן 3, ו- HIV 4,5.
המטבוליזם של מנוחה מונוציטים מופעל שונה באופן דרמטי, עם מונוציטים נח ניצול מטבוליזם חמצוני מונוציטים מופעל ניצול מטבוליזם glycolytic (כלומר, התסיסה של גלוקוז לקטט) 6. הפעלת מונוציטים גורם ביטוי של מובילי גלוקוז המאפשר ספיגת הגלוקוז מוגבר מטבוליזם glycolytic 7. טרנספורטר 1 גלוקוז מונוציטים (GLUT1) הוא טרנספורטר אחד כזה שהוגבר במהלך ההפעלה וביטויו הוכח להוביל לייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים נitro ו ברקמת השומן של עכברים שמנים 8. זיהום של שורת תאים monocytic ידי הרפס הקשור סרקומה קפוסי מוביל הגברת הביטוי התאי של GLUT1 9, והראינו לאחרונה כי במהלך זיהום כרוני HIV גידול באחוז מונוציטים להביע GLUT1 נוכחים במהלך ההדבקה שטופלו בטיפול תרופתי מטופל בשילוב 10. יחדיו, מחקרים אלה מראים כי ספיגת הגלוקוז וחילוף החומרים glycolytic ידי מונוציטים הם היבטים חשובים של מחלות דלקתיות רבות. לפיכך, שיטה פשוטה למדוד ביטוי GLUT1 מונוציטים ספיג הגלוקוז במהלך הומאוסטזיס ומחלות דלקתיות עשויות להועיל במגוון רחב של חוקרים.
מונוציטים האדם הם הטרוגניים, להיות מורכב משלושה תת ברורים שיכולים להיבדק על ידי ביטוי ההפרש של CD14 סמנים פני התא CD16 11,12. מונוציטים קלסי להביע רמה גבוהה של CD14 אך אינו מבטא CD16 (CD14 ++ CD16 -), מונוציטים ביניים להביע רמה גבוהה של CD14 ו ברמה בסיסית של CD16 (CD14 ++ CD16 +), ומונוציטים הלא קלאסית להביע רמה נמוכה של CD14 ורמה גבוהה של CD16 (CD14 + CD16 ++). מונוציטים מבטאי CD16 מכונים CD16 + מונוציטים, אשר לעומת CD16 – יש מונוציטים ביטוי גבוה של ציטוקינים דלקתיים ויכולת אנטיגנים נוכחי בצורה יעילה יותר 13,14. כ -10% מונוציטים להביע CD16 במהלך הומאוסטזיס עם אחוזים גבוהים שנצפו במהלך דלקת 15. תת-אוכלוסיות מונוציטים המשויכות מצבי מחלה מסוימים יכולות להיות סמנים ביולוגיים שימושיים להתקדמות מחלה ומחלות 16.
מטרתנו הייתה לזהות שיטה שיכולה למדוד ביטוי נשא גלוקוז ספיגת הגלוקוז על ידי מונוציטים האדם subpopulations מונוציטים בתנאים קרוב PHYתנאי siological ככל האפשר. מחקרים קודמים נמדד ביטוי נשא גלוקוז מונוציטים ספיגת הגלוקוז 17,18, אם כי שיטות אלה בחן מונוציטים מבודד שיכול שינו ביטוי חלבון לעומת מצבים פיזיולוגיים 19, ולא במחקר הקודם בחן subpopulations מונוציטים האדם. באמצעות זרימה רבת פרמטריים cytometry, אנו מתארים שיטה לבחון ביטוי נשא גלוקוז ספיג של אנלוגי גלוקוז ניאון 2-NBDG ידי מונוציטים הכוללים תת-אוכלוסיות מונוציטים (מבוסס על CD14 וביטוי CD16) בתוך דם unmanipulated כולו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה פשוטה לבחון ביטוי נשא גלוקוז ספיג אנלוגי גלוקוז ניאון על ידי תת-אוכלוסיות מונוציטים ו מונוציטים בדם כולו. לפי הערכה ספיגה 2-NBDG בדם כולו, טכניקה זו מאפשרת בתנאים דומים לאלה in vivo. מחקר קודם בחן 6-NBDG לספיגת מונוציטים מופרדים דם כולו על י…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המרכז האוסטרלי ל- HIV וצהבת מסוג וירולוגיה מחקר (ACH 2) ומענק התפתחותיים 2010 (CNIHR) מאוניברסיטת מרכז וושינגטון לאיידס מחקר (וכפר), תוכנית הממומנות על ידו תחת AI027757 מספר הפרסים אשר נתמך על ידי NIH מוסדות ומרכזים הבאים (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP הוא הנמען של מענק 2 CNIHR ו ACH. SMC הוא הנמען של מועצת המחקר הלאומית לבריאות ורפואה של אוסטרליה (NHMRC) ומנהלת מחקר המלגה. המחברים בתודה להכיר בתרומת עבודה זו של תכנית תמיכת התשתית ויקטוריאני התפעולית המתקבלת במוסד ברנט. אנו מכירים את עזרתו של גזה Paukovic ואווה אורלובסקי-אוליבר ממתקן Core cytometry זרימה AMREP עבור זרימת cytometry הדרכה וייעוץ טכני. אנו מודים אנגוס מורגן לאימון התקשורת וארגון לצלם וידאו. תודתנולג'סי מאסון Jehad עבד-אלעזיז ק Alzahrani לסיוע במעבדה במהלך לצלם וידאו. אנו מודים המאמצים של ד"ר דוד Simar בבית הספר למדעי הרפואה, UNSW, אוסטרליה שהציעו ייעוץ מתודולוגי קריטי. CSP רוצה להודות www.nice-consultants.com להתייעצויות גרפיות.
מחברי תרומה:
CSP הגה את הפרויקט, שנועד וערך ניסויים, ניתוח ופרשנות נתונים, וכתב את כתב היד. JJA לפרש נתונים וכתב את כתב היד. TRB כתב את כתב היד. JMM לפרש נתונים, הציע הצעות רוחניות קריטיות, כותב ביקורת על כתב היד. SMC לפרש נתונים, הציע הצעות אינטלקטואליות ביקורתיות ביקורת על כתב היד.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
