Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen
Summary
Makrophagen sind Plastikzellen des hämatopoetischen Systems, die eine entscheidende Rolle bei der schützenden Immunität und Homöostase haben. In diesem Bericht beschreiben wir optimierte in vitro- Techniken zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von pfropf-infiltrierenden regulatorischen Makrophagen, die sich im transplantierten Organ unter toleranten Bedingungen ansammeln.
Abstract
Makrophagenakkumulation in transplantierten Organen ist seit langem als ein Merkmal der Allotransplantatabstoßung erkannt worden 1 . Immunogene Monozyten infiltrieren das Allotransplantat früh nach der Transplantation, pflegen eine pfropfreaktive Reaktion gegen das transplantierte Organ und initiieren die Organabstoßung 2 . Jüngste Daten deuten darauf hin, dass unterdrückende Makrophagen eine erfolgreiche Langzeit-Transplantation 3 ermöglichen und für die Induktion der Transplantationstoleranz erforderlich sind 4 . Dies deutet auf ein multidimensionales Konzept der Makrophagen-Ontogenese, Aktivierung und Funktion hin, das eine neue Roadmap für die Isolierung und Analyse der Makrophagen-Funktion erfordert. Aufgrund der Plastizität von Makrophagen ist es notwendig, eine Methodik zur Isolierung und Charakterisierung von Makrophagen in Abhängigkeit von der Gewebeumgebung vorzusehen und ihre Funktionen nach verschiedenen Szenarien zu definieren. Hier beschreiben wirEin Protokoll für die Immuncharakterisierung von Transplantat-infiltrierenden Makrophagen und die Methoden, mit denen wir ihre Fähigkeit, die CD8 + T-Proliferation zu hemmen, funktionell zu bewerten und die CD4 + Foxp3 + Treg-Expansion in vitro zu fördern.
Introduction
Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die Funktion von Gewebe-infiltrierenden Makrophagen, die aus kardialen Allotransplantaten isoliert wurden, nach ihrer Fähigkeit, T-Zell-Antworten zu modulieren, zu untersuchen. In der Literatur weithin beschrieben, sind fluoreszierende Zellverfolgungsfarbstoffe in Kombination mit Durchflusszytometrie mächtige Werkzeuge, um die suppressive Funktion spezifischer Zelltypen in vitro und in vivo zu untersuchen . Unser Protokoll folgt dem Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) -Verfahren zur Überwachung der Lymphozytenproliferation in vitro .
Wenn eine CFSE-markierte Zelle sich teilt, erhält ihre Nachkommenschaft die Hälfte der Anzahl der Carboxyfluorescein-markierten Moleküle 6 . Die entsprechende Abnahme der Zellfluoreszenz durch Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen, wobei die Kapazität der suppressiven Makrophagen überwacht wird, um T-Zell-Immunantworten zu modulieren. Da CFSE ein Fluorescein-basierter Farbstoff ist, ist er mit einem brOad Bereich der anderen Fluorochrome, so dass es für Multi-Farb-Durchflusszytometrie. Die geeignete Wahl der Fluorochrome für die Phänotypisierung ist auch wichtig, um eine übermäßige spektrale Überlappung zu vermeiden und die Unfähigkeit, Antikörper-positive Zellen zu erkennen, insbesondere mit sichtbaren Proteinfarbstoffen wie CFSE 7 .
Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen gegenüber alternativen Techniken, die die Zellproliferation messen, wie der Thymidin-Inkorporationstest, der radioaktiv markiertes Thymidin (TdR) 8 verwendet. Dieser Assay verwendet tritiiertes Thymidin ( 3 H-TdR), das während der Mitosezellteilung in neue Stränge chromosomaler DNA eingebaut wird. Eine Sicherheitsbedeutung, die mit diesem Assay verbunden ist, ist die Verwendung von Radioisotopen, da ein Szintillationsbeta-Zähler verwendet wird, um die Radioaktivität in der aus den Zellen gewonnenen DNA zu messen, um das Ausmaß der Zellteilung zu bestimmen. Methodisch ist der tritiierte Thymidin assAy ist nicht flexibel genug, um wichtige klinische Laborbeschränkungen wie z. B. niedrige Anzahl von Zellen und verzögerte Analyse nach der Färbung anzupassen. Im Gegenteil wurde gezeigt, dass die CFSE-Färbung die Zellproliferation verhindert und kritische Aktivierungsmarker wie CD69, HLA-DR und CD25 9 stört. Daher ist das Verständnis von Vorteilen und Einschränkungen jeder Methodik, insbesondere bei mehrfarbigen Studien, bei denen mehrere Farbstoffe verwendet werden, um verschiedene Zelltypen zu verfolgen, entscheidend für die Erzielung genauer und reproduzierbarer Ergebnisse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, mit denen wir pfropf-infiltrierende myeloide Zelluntergruppen in einem experimentellen Mausmodell der Herztransplantation immunocharakterisieren, was auch für andere Gewebe in verschiedenen murinen experimentellen Modellen gilt. Die Niederdruckzellsortierung bei 20 psi war die bevorzugte Methode, um eine gute Ausbeute an reinen Zelluntergruppen zu isolieren. Die Aufrechterhaltung der Reinheit jeder myeloiden Teilmenge ist entscheidend, um schlüssige Ergebnisse der Unterdrücku…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir anerkennen die technischen Beiträge der Durchflusszytometrie, der Mikrochirurgie und der Bio- / Pathologie-Zentren der Forschungs-Exzellenz am Berg Sinai. Diese Arbeit wurde von der COST-Aktion BM1305 unterstützt: Maßnahmen zur Fokussierung und Beschleunigung zelltolerogener Therapien (A FACTT), dem Entwicklungszentrum des Sinai Recanati / Miller Transplantationsinstituts, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R und SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
