Summary

フルーツフライを飼育<em>キイロショウジョウバエ</em>無菌およびノトバイオート条件の下で

Published: July 30, 2016
doi:

Summary

無菌およびノトバイオート条件の下でショウジョウバエを飼育するための方法が提示されています。フライ胚は、次亜塩素酸ナトリウムでdechorionated無菌の食事に無菌的に移し、密閉容器で飼育されています。細菌にダイエットや胚を接種すると、ノトバイオート団体を招き、細菌の存在が全身ショウジョウバエホモジネートをめっきすることによって確認されました。

Abstract

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

ほとんどの動物は密接誕生から死1に細菌( '細菌叢')に関連付けられています。微生物フリー( '純粋')および微生物関連( '従来')動物の比較は、微生物が代謝、栄養、血管、肝臓、呼吸器系、免疫学、内分泌、および神経機能2を含む動物の健康の多様な側面に影響を示しています。果実はキイロショウジョウバエを飛ぶ微生物3,4の存在下で、これらのプロセスの多くを理解し、動物の健康の5,6上の微生物の影響を研究するための重要なモデルです。いいえ細菌種は、すべての個人(「コア」)に存在しないが、 アセトバクター及びラクトバチルス種が数値的に両方の実験室で飼育し、野生キャッチDの微生物叢を支配しますメラノ(Komagataeibacterグルコノ含む)その他Acetobacteraceae、Firmi(このような腸球菌およびロイコノストックなど)cutisの複数形、および腸内細菌は、低量のいずれかでショウジョウバエの個体で頻繁に存在している、または多量7-12で不規則に存在します。

ショウジョウバエや哺乳類の微生物叢は、世代14,19内および全体の不定です。微生物叢に依存する特性を測定する際の微生物叢の心変わりは、表現型のノイズにつながることができます。例えば、 ショウジョウバエ 15-18Acetobacteraceae影響脂質(トリグリセリド)の記憶。 Acetobacteraceaeは、別の19に比べて1つのバイアルのハエで、より豊富である場合は、同質遺伝子ハエは異なる表現型20を持つことができます 。マウス14内細菌叢の心変わりの問題の解決策は、仔マウスに、それぞれの新しい世代(変更されたSchaedler叢)を8優勢微生物種の定義されたコミュニティを導入することで、1960年代から実践してきました各子犬をマウス細菌叢の同じキーメンバーにさらされていることを保証します。微生物叢は、研究32の主要な目標ではなく、実験条件の様々な重要な微生物の存在を確実にするために先例を設定した場合でも、この練習は、細菌叢の組成を制御します。

ショウジョウバエの栄養上の微生物の影響を定義するには、純粋フライラインを導出するためのいくつかのプロトコルは、胚の次亜塩素酸dechorionation(いずれかの派生デノボ各世代または滅菌ダイエットへの転送によって世代的に維持)と抗生物質治療13を含む、開発されてきました。このような抗生物質治療とシリアル転送、 デノボ dechorionationとの交絡変数( 例えば 、卵の密度、残留汚染する微生物、オフターゲット抗生物質の効果)の対より細かく制御の両方のための使いやすさと迅速性などの異なるアプローチの利点があります。かかわらず、方法の胚を無菌ために、指定された微生物種の準備、導入が定義されている( 'ノトバイオート')コミュニティとショウジョウバエの文化を可能にします。また、Schaedler叢の使用を模倣し、このコミュニティは、各バイアル中の形質に影響を及ぼす微生物の存在を確保し、細菌叢の心変わりの合併症を回避するために(ステップのみ6-7以下)従来から産卵された卵に接種することができました。ここでは、胚のデノボ dechorionationにより無菌とノトバイオートショウジョウバエを上げるためのプロトコルを記述し、導入や、汚染微生物の分類群の存在を確認するため。

Protocol

1.文化の細菌(卵をピッキングする前にスタート〜1週間) 修正されたMRS 20(のMMR)プレートおよびブロスチューブ( 表1)を準備します。各100ミリメートルペトリ皿に寒天20ミリリットルののMMRを注ぎ、/ドライ一夜を冷却することを可能にする、または5ミリリットルののMMRは、18ミリメートルの試験管に培養液。 ストリークアセトバクター…

Representative Results

無菌ハエの成功飼育は、Dの全身homogenizationsからなしのCFUの単離により確認されていますショウジョウバエ大人( 図1)。また、メッキホモジネート利回りコロニー場合、バイアルが汚染され、廃棄されるべきです。ノトバイオートハエ、4つの細菌単離物の各々は、成体ハエ( 図1)に関連付けられた総生存のCFUの差を示す、5成?…

Discussion

ここで説明する方法は、一緒に無菌大人18,27のシリアル転送または抗生物質治療13,18を含む無菌ハエを、飼育する別の方法で、胚dechorionation 8,11,18,25,26,27のためのいくつかのアプローチの一つです。その他dechorionation方法は、エタノール洗浄を含み、11,25,26を減らすか、8次亜塩素酸塩処理を拡張します。別の洗浄ステップは、異なるフライ遺…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロトコルのいくつかの詳細も原稿に役に立つコメントを提供博士アダムドブソン、の助けを借りて最適化しました。この作品は、国立衛生研究所財団(FNIH)認可番号R01GM095372(JMC、A(CN)W、AJD、およびAED)によってサポートされていました。 FNIHグラント番号1F32GM099374-01(PDN)、およびブリガム・ヤング大学のスタートアップ資金(JMC、MLK、MV)。出版費用は、ブリガム・ヤング大学生命科学の大学と植物や野生生物科学科によってサポートされていました。

Materials

Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher–Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100343125 http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes Laboratory Product Sales TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1000μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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Citer Cet Article
Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

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