Нейродегенерации в животной модели хронического амилоид-бета олигомера Infusion нейтрализуется антителами Лечение пронизаны осмотические насосы
Summary
To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Abstract
Спад в гиппокампа-зависимой явной памяти (память для фактов и событий) является одним из самых ранних клинических симптомов болезни Альцгеймера (AD). Хорошо известно, что потеря синапсов и последующего нейродегенеративные являются лучшими предикторами нарушение памяти в AD. Последние исследования подчеркивают нейротоксическое роль растворимых бета-амилоида олигомеров (Aβo), которые начинают накапливаться в человеческом мозге приблизительно от 10 до 15 год до того, как клинические симптомы становятся очевидными. Многие отчеты показывают, что растворимые Aβo коррелируют с дефицитом памяти в моделях AD и людей. Aβo-индуцированной нейродегенерации наблюдается в нейронные и мозга культур срез был более сложным, чтобы воспроизвести во многих животных моделях. Модель повторных инфузий Aβo показано здесь преодолеть эту проблему и позволит решить две ключевые области для разработки новых методов лечения болезни модифицируя: идентифицировать биологические маркеры для диагностики ранней AD, и определить молекулярную Mechaханизмы лежащих в основе Aβo-индуцированные дефициты памяти в начале нашей эры. Так как растворимого Aβo агрегата относительно быстрой в нерастворимые фибриллы A & beta, которые коррелируют плохо с клиническим состоянием пациентов, растворимый Aβo получают свеже и вводят один раз в день в течение шести дней, чтобы произвести заметное гибель клеток в гиппокампе. Мы использовали канюлю специально разработанный для одновременного вливания Aβo и непрерывной инфузии Aβo антитела (6E10) в гиппокампе с помощью осмотических насосов. Этот инновационный метод в естественных условиях теперь могут быть использованы в доклинических исследованиях для проверки эффективности новых методов лечения AD , которые могут препятствовать отложению и нейротоксичность Aβo в предварительно слабоумием пациентов.
Introduction
Он был первоначально предполагалось , что накопление нерастворимых A & beta видов в головном мозге занимает центральное место в патогенезе АД. 1,2 Однако амилоидные бляшки обнаружены также в некоторых когнитивно нормального пожилых людей. 3-7 Чтобы преодолеть плохую корреляцию , существующую между отложениями зубного налета и когнитивных нарушений в AD, последние отчеты показали наличие токсичных растворимых Aβo в начале заболевания, которые коррелируют намного лучше с клиническим состоянием пациентов. 8-14 Поскольку процесс олигомеризации Ар очень динамична, было высказано предположение о том , что нейротоксичность индуцируется различными Aβo вместо только одного конкретного типа олигомера. 14-16 Поскольку многие исследования показали , что Aβo может инициировать синапса дисфункций до начала синапса и потери нейронов, 17-24 современные теории показывают , что A & beta ;, связанных с лечение может быть эффективным в в начале нашей эры, а не на более поздних этапах, как тестирование до сих пор в клинических испытаниях.
Одной отличительной чертой особенностью AD патогенеза является массовое и широко распространенная гибель клеток наблюдается на поздних стадиях заболевания, а также значительное синапса и гибель нейронов наблюдается в локализованных областях мозга, когда дефицит памяти становятся обнаружены на клиническом уровне. Перфорантных путь , который выступает из энторинального коры (EC) в зубчатую извилину (DG) заметно возмущенных в раннем начале нашей эры. 25,26 Во время продромального состояния АД при умеренных когнитивных нарушений (MCI) становится очевидной значительную гибель клеток обнаруживается в EC, а также синаптической потери в DG. 25,26
Хотя большое количество доказательств , выявило токсическое действие растворимого Aβo в начале нашей эры, 8-14 Aβo-индуцированной нейродегенерации наблюдается в культуре нейронов или органотипического срез мозга культуры был более сложным , чтобы воспроизвести на животных моделях. 27 Большинство трансгенной н.э. модели сверхэкспрессииβ имеют амилоидные бляшки, тау гиперфосфорилирования, синаптическую дефицит и дефицит памяти. 27 Тем не менее, эти модели были гораздо менее успешными в смерти моделирование клеток наблюдается в гиппокампе больных AD. Для преодоления этих технических проблем, мы разработали модель, основанную на внутримозговых инфузий растворимого Aβo. Ранее мы сообщали , что повторные гиппокампа настои растворимого Aβo вызывают постепенное потерю нейронов и тау гиперфосфорилирования, два патологические признаки , связанные со снижением памяти в AD. 28 Здесь мы показываем новый метод для тестирования терапии AD с использованием канюлей специально разработанный для одновременного инфузий Aβo и непрерывное вливание Aβo антитела (6E10) с осмотических насосов.
Осмотические насосы обеспечивают уникальный способ тестирования в естественных условиях эффективность любого антитела (или других соединений) против Aβo-индуцированной нейродегенерации непосредственно на месте инфузии Aβo. Таким образом, эти насосы ReprESENT удобный инструмент для создания прочной доказательство правильности концепции о механизмах действия потенциальных терапевтических агентов в AD. Поскольку недавние сообщения указывают на критическое воздействие растворимого Aβo на ранних стадиях нашей эры, многие методы лечения, направленные на Aβo фактически проходит проверку академических и фармацевтических лабораториях. Эта новая животная модель позволяет имитируя синаптической и потерю нейронов наблюдается в начале нашей эры, и осмотические насосы используются для непрерывного лечения влить агентов специально на инфузионной сайте Aβo. Повторяющиеся неудачи AD терапии испытанных в течение последних нескольких лет в легкой до умеренной пациентов как побудили исследователей начать испытания в предварительно слабоумием пациентов до Aβo начинают накапливаться в изобилии и генерировать необратимое повреждение мозга. В этом контексте, тестирование новых соединений, которые предотвращают осаждение и, следовательно, нейротоксичность Aβo может представлять интерес в доклинических пациентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть важные шаги в рамках этого протокола, которые требуют особого внимания. При имплантации канюли, избежать сдачи стоматологического цемента, когда он слишком жидкости, чтобы предотвратить блокирование отверстие второго канюлю. Важно, чтобы поместить стоматологического цемента на свободном конце P50 катетера прикрепленной к насосу, чтобы предотвратить раздражение и возможного воспалительного ответа. День стереотаксической хирургии, использование фиктивного канюлю, которые имеют одинаковую длину, как направляющей канюли, чтобы избежать блокировки канюлю. Тем не менее, после установки насосов используют более короткую фиктивный канюлю, что остановить до того, как угол руки канюли для обеспечения надлежащего вливания раствора от насоса к гиппокампе. Монитор тесно Aβo настои и убедитесь, что воздушный пузырь сделано в катетеров постоянно движется во время инфузий. Всегда убедитесь, что инъекции канюля полностью вставлен в направляющую канюлю во время инфузий.
Если проблема заключается в столкновение во время инфузии АрУбедитесь, что внутренняя канюля не блокируется. Если это так, то промойте стерильной дистиллированной воды через внутреннюю канюлю. Если направляющая канюля забит, повернуть внутреннюю канюлю в направляющую канюлю. В противном случае переместите внутреннюю канюлю вверх и вниз. Разногласия в прильнуть может быть стресс для крыс, особенно в первый день. Для того, чтобы уменьшить стресс животного, мы рекомендуем, чтобы манипулировать и приучить крыс к прильнуть перед стереотаксической хирургии.
Многие преимущества можно отнести к этим романом и гибкий подход в естественных условиях. В самом деле, природа Aβo впрыскивается может быть точно контролировать до инфузии, а другой тип препаратов A & beta ; (например , синтетический против мозга , полученных растворов A & beta ; ) может быть введен , чтобы оценить их нейротоксичность в естественных условиях. Эта модель также может быть использована для изучения механизмов , с помощью которых различные виды A & beta ; (например, мономеры, низкой и высокой молекулярной массой олаigomers, протофибрилл) могут вызывать нейротоксические эффекты в естественных условиях, и как методы лечения , такие как иммунотерапия может противодействовать их пагубное воздействие на мозг. Так как настои выполняют в бодрствующих, свободно движущихся животных, нет искажающие эффекты между анестетиков и раствором Aβo на сигнальные пути, как показано в предыдущих исследованиях. 32,33 Настои в свободно движущихся животных также совместимы с поведенческим тестированием любой время до и после инфузий.
Настои Aβo и насосной установки может быть сделано в животных разных возрастов, чтобы определить влияние Aβo и лечения в процессе старения. Так как нейродегенеративные происходит в непосредственной близости от места введения, Synapse и потерю нейронов могут быть вызваны в различных и локализованных областях головного мозга. Обеспечением настой Aβo и контроля (транспортного средства или скремблирования A & beta;) позволяет контролировать любое изменение в пределах того же самого животного. С другой стороны, Aβo или контроль зольutions может быть введен в двустороннем порядке в правом и левом гиппокампе, например, при тестировании животных в поведенческих задач. Настой Aβo и лечение может быть сделано одновременно или в качестве альтернативы насосы могут быть установлены после Aβo инфузии, чтобы оценить, если лечение является эффективным после осаждения Ар. Тот же самый протокол, описанный здесь, также могут быть использованы при выполнении интрацеребровентрикулярное настои Aβo. Эффект Aβo на внутриклеточных сигнальных путей могут быть оценены до и после потери нейронов в разумно короткие сроки. Доза и число A & beta; инфузий также можно регулировать, чтобы получить более или менее серьезные Ар патогенность.
Хотя очень универсальный, этот метод имеет некоторые ограничения. Канюля имплантация производит механическое разрушение ткани и нейровоспаления в течение первых нескольких дней после операции. Таким образом, необходимо подождать, по крайней мере, через одну неделю после операции перед началом Aβo инфуSion, и добавить соответствующие элементы управления (инъекции транспортного средства или неактивной) карабкаются Ар, чтобы принять во внимание эти события. Кроме того, лишь небольшой объем Aβo, может быть введен, чтобы ограничить диффузию раствора.
Осмотические насосы представляют собой удобный и уникальный метод доставки для доклинической проверки агентов, предназначенных для предотвращения Ар-индуцированной нейродегенерации. Поскольку иммунотерапия с антителом 6E10 было показано ранее , чтобы уменьшить накопление Ар в головном мозге, 31 мы использовали антитела 6Е10 в качестве концепции доказательством правильности для проверки нашего нового подхода в естественных условиях. Используется осмотических насосов в этой модели в настоящее время могут быть использованы для разработки новых методов лечения заболеваний изменения, которые могли бы предотвратить отложение и нейротоксичность Aβo у больных доклинических АД.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Materials
| Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
| PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
| Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
| Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
| Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
| Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
| Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
| Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
| Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
| Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |
References
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer’s disease. Hypothesis: Alzheimer’s disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
- Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
- Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer’s disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
- Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and “preclinical” Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
- Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
- Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
- Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
- Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer’s disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
- Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
- Hardy, J. Amyloid double trouble. Nat. Genet. 38, 11-12 (2006).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
- McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
- Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochimie. 45, 15157-15167 (2006).
- Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
- Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
- Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
- Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B. Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 14745-14750 (2009).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
- Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
- Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
- Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
- Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
- Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer’s disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
- Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer’s Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer’s disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
- Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E. Alzheimer’s disease and anesthesia. Front. Neurosci. 4, 272 (2011).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
