慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

倫理の声明：このプロジェクトのための動物プロトコルは、動物ケアに関するカナダの協議会のガイドラインに準拠してHôpitalデュサクレクール寺院モントリオールの動物ケア委員会の承認を得ました。 定位手術の前に1.カテーテルの準備浸透圧ポンプを有するカニューレを接続するために使用されるPE50カテーテルを（長さ6 cm）で ​​切断した （ 図1A参照）。人工脳脊髄液（aCSFの）とPE50カテーテルを記入し、カテーテルの両端を密封します。使用するまで4℃でカテーテルを保管してください。 定位2.カニューレ注入無菌状態で手術を行います。オートクレーブにより、すべての手術器具や材料を滅菌します。徹底的に定位固定装置と作業領域をきれいにし、そして70％のエタノール溶液で消毒。外科手術用マスク、ヘアボンネットと滅菌手袋を着用してください。腹腔内（IP）をケタミン及びキシラジンの溶液（100ミリグラム/ kgおよび10mg / kgのそれぞれ）を注入することによってラットを麻酔。穏やかなつま先のピンチの後に動きをチェックすることにより、麻酔を確認してください。 手術前に麻酔をかけ、動物、少なくとも30分に皮下（s）;非ステロイド性抗炎症薬（1ミリグラム/キログラムメロキシカム）を注入します。 バリカンを用いて動物の頭を剃るとグルコン酸クロルヘキシジンの溶液2％、イソプロピルアルコール2％の3回で皮膚を消毒します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医の眼軟膏を適用します。 耳のバーで定位フレームに動物を置きます。定位フレームのホルダアーム上の1つのカニューレを修正しました。頭の上に（SC）局所麻酔薬（ブピバカイン（1.5ミリグラム/ kg）およびリドカイン（1.5ミリグラム/キログラム）を注入します。麻酔は、3％のイソフルランを提供するノーズコーンを配置することによって、全体の手順の間に維持している。全体手術野はする必要がありますオフドレープが、それはより良い技術を実証するためにここで行われていませんでした。 メスで頭の上に3センチメートルの切開を行います。明確な頭蓋骨を残すために切開の周りに4クランプを取り付けます。ラウンドチップはさみを使用して、動物の肩甲骨の間の皮膚の下にポケット（2×2 cm 2の）を作ります。 ブレードと頭蓋骨の骨膜をこすり。出血場合頭蓋骨にガーゼパッドを適用します。 頭蓋骨は平坦でよく定位フレーム上に整列されていることを確認します。頭蓋骨が平坦であることを確認するために、高さはブレグマでラムダで座標を確認してください。基準点として使用されるブレグマの座標を取ります。 ブレグマから出発し、海馬に両側性に移植される2つのガイドカニューレの座標計算（前後： – 0.42センチメートル;内外：0.30センチメートル±を、背腹： – 0.28センチメートルPaxinosとワトソンラット脳アトラスに応じて）29は、 。示しますマーカーとカニューレの位置。 両方のカニューレの注入点で頭蓋骨に穴（0.5ミリメートル）を開けます。歯科用セメントを適用するときにカニューレを固化するネジを挿入するために、他の二つの穴それらの点の上下に約5mmのドリル。 以前にメスでaCSFので満たされたカテーテルの一方の端をカットし、カニューレの角度アームに挿入します。歯科用セメントとの最初のカニューレを修正しました。第二のカニューレ上の位置の周りに歯科用セメントを置かないようにしてください。 その後、最初のカニューレからホルダアームを削除し、その中の第二のカニューレを固定し、3分 – 2のための歯科用セメントの乾燥をしてみましょう。繰り返しは、2.11と2.12を繰り返します。両方のガイドカニューレにダミーカニューレを入れてください。ダミーとガイドカニューレは、組織浸潤およびカニューレを遮断を防止するために、同じ長さのものであることを確認してください。 以前に動物の肩甲骨の間に作られたポケットの中に両方のカテーテルの自由端を挿入します。クランプを外し、で皮膚をステッチ縫合糸4-0。 注：トップガイドカニューレは、今後のAβo注入のためにアクセスできる必要があります。 定位フレームから動物を削除し、そのケージに戻ってそれを置きます。動物が目覚めるまで、手術後の回復時には、暖房水毛布の上にケージを置きます。必要に応じて、ラットは熱から離れて移動することができますので、ケージは、パッドの上に部分的であるべきです。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、常に動物を監視します。 綿密なモニタリングの下で​​10日間手術から回復するために動物施設にラットを返します。 注：完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。メロキシカム（1ミリグラム/ kg）を、痛みを治療するための手術後2日間は一日一回与えられています。 3.浸透圧ポンプのインストールコントロールIgG1、ある日、インストールの前に、6E10抗体（100μlの1mg / mlの）と浸透圧ポンプを埋めます抗体（1 mg / mlで、100μl）を無菌条件下で製造者の指示に従って。ポンプを活性化するために37℃で一晩滅菌蒸留水でポンプを保管してください。 浸透圧ポンプ（7日間0.5μL/時間）をインストールするためにイソフルラン3％のラットを麻酔。肩甲骨の間にひげをそるとグルコン酸クロルヘキシジンの溶液2％、イソプロピルアルコール2％で皮膚を消毒します。ガイドカニューレに接続されたPE50カテーテルを配置するために、肩甲骨の間メスで2センチの切開を行います。 メスで歯科用セメントを含むPE50カテーテルの端をカットします。 PE50カテーテルに浸透圧ポンプを接続し、接続を確保するためのポンプとカテーテル接合部にいくつかの歯科用セメントを追加します。 縫合糸4-0でしっかりと肌をステッチ。暖房水パッドの上に戻って、そのケージに動物を置きます。イソフルラン麻酔（約5分）から急速に目を覚ます動物を観察します。 注：手術はアプロかかりますximately 5〜10分。 4.Aβo覚醒中の煎茶と自由に動くラット以前に報告されているようAβo溶液（0.2μgの/μl）を準備します。28,30Aβoが注入前に室温で1時間、動的かつ自然に集約できるようにします。 輸液ポンプに210μlの注射器を取り付けます。滅菌蒸留水5μlのシリンジを埋めます。メスで長さが約60cmに2 PE50カテーテルをカット。 1ミリリットルのシリンジと21G針を用いて、滅菌蒸留水で両方のカテーテルを埋めます。 カテーテルの一端に1ミリリットル注射器を維持し、ハミルトンシリンジにもう一方の端を接続します。 1ミリリットル注射器を取り外し、カテーテル内に気泡がないことを確認してください。 PE50カテーテルの終わりに内部カニューレを挿入します。ハミルトンシリンジにμlでTO1までの滅菌蒸留水を使用して、PE50カテーテルに接続された内部カニューレを埋めます。 pで気泡を作ります2μlのまでピストンをバックulling。 ピペッティング順守の最低限の先端を使用してAβo液を混ぜます。混合中に気泡を形成することは避けてください。 3.5μlのまでピストンを引き戻すことにより、Aβo液の1.5μlの持つ内部カニューレの両方を入力します。 両方のカテーテルで行われ、気泡の前後にマーカーで線を作成します。これは現在進行中の輸液のチェックポイントとして機能します。注入のために、輸液ポンプの近くにケージを持参し、そのカバーを取り外します。 寄り添いにおけるラットを置き、しっかりとラットの頭部を固定化するために、その首に寄り添いの腕をこすり。 2ガイドカニューレからダミーカニューレを取り外します。以前にガイドカニューレで製造した内部カニューレを挿入します。彼らは完全に挿入し、ガイドカニューレのベースにはよく固定されていることを確認します。 寄り添いからラットを放し、競合ストレスを制限するために、そのケージに戻ってそれを置きます。カテーテルはtogetねじったりしないことを確実にするために密接に監視彼女と注入が適切に行われています。 輸液ポンプの電源をオンにします。 0.1μL/分（10分）の速度でAβo溶液1μlを注入します。注入中、2.5μlの3.5μLから注射器ピストンが移動することを確認し、両方のPE50カテーテル内の気泡が連続的に移動すること。 Aβoソリューションの効率的な拡散を可能にするために注入した後、別の5分間の場所に内部カニューレを残します。注入溶液の還流を防止するために、内部カニューレ、蓋をガイドカニューレを除去するために戻って寄り添いにおけるラットを持参してください。カニューレの角度アーム直前に停止ダミーカニューレを使用してください。そのケージに動物を返します。 連続6日間にわたって1日1回Aβo注入を繰り返します。断頭により動物を安楽死させます。