Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Vários métodos de cultura in vitro foram descritas para gerar macrófagos de osso derivadas de medula (BMDMs) e DCs derivadas da medula óssea (BMDCs) utilizando um ou uma combinação de factores de crescimento. BMDMs pode ser gerado através da cultura de células da medula óssea utilizando um factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) ou GM-CSF ^{a 1,2.} Para BMDCs, a adição de ligando de FLT3 para a cultura de medula óssea dá origem a DCs clássicos e plasmocitoides não aderentes (CD11c ^alta MHCII ^alta e CD11c ^Lo /, B220 ^+, respectivamente), após 9 dias de cultura em ^3,4. Em contraste, células não-aderentes gerado após 7 a 10 dias em cultura com GM-CSF sozinho ^5,6, GM-CSF e IL-4 ^7, ou GM-CSF e o ligando de FLT3 ^8,9 gerar BMDCs assemelha-se mais estreitamente DCs inflamatórias ^(alta CD11c, CD11b MHCII ^{alta +) 10.} Embora estas culturas in vitro são utilizados para gerar ou macrófagosDCs, não é claro se cada cultura dá origem a populações puras. Por exemplo, embora as células aderentes nas culturas de GM-CSF são descritos para ser macrófagos ^5, as células não aderentes a partir da mesma cultura são utilizados como DCs ^6,11-13, com o pressuposto de que eles são homogéneos e qualquer variabilidade observada é devido a diferentes fases do desenvolvimento ^14,15. Além disso, estudos têm encontrado GM-CSF a ser um factor de crescimento essencial para o desenvolvimento de macrófagos alveolares in vivo ^16,17, e pode ser utilizado in vitro para gerar macrófagos alveolares do tipo ^16,17,18.

Para além de adesão, os procedimentos para a produção de macrófagos e células dendríticas a partir de GM-CSF tratado culturas de medula óssea são muito semelhantes, sugerindo heterogeneidade pode existir dentro de GM-CSF culturas de medula óssea. Este facto parece ser o caso, como dois trabalhos relatam a presença de BMDMs na fracção não-aderente de culturas BMDC. Em um papel, que identified uma população de células como CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^mid, MerTK ⁺ e CD115 ^+, que expressa uma assinatura a expressão de genes que se assemelhava mais estreitamente macrófagos alveolares e tinha uma capacidade reduzida de activar células T ^19. O segundo papel utilizado MHCII e FL-HA para identificar uma população de macrófagos-like alveolar (CD11c ^+, MHCII ^{média / baixa,} FL-HA ^alta), que era distinta da imaturo (CD11c ^+, MHCII ^mid, FL-HA ^baixo) e madura DCs (CD11c ^+, MHCII ^alta), tanto fenotipicamente e funcionalmente ^18. Estes papéis ambos ilustram que as culturas GM-CSF BMDC são heterogêneas, contendo tanto populações DC, indicando que deve ser tomado cuidado ao interpretar os dados a partir de culturas BMDC macrófagos e.

Este protocolo descreve como isolar medula óssea, as células de medula óssea de cultura em GM-CSF, e identificar o macrófago alveolar semelhantepopulação dos DCs imaturos e maduros na cultura de medula óssea por citometria de fluxo utilizando FL-HA de ligação e expressão MHCII. Este procedimento é baseado no procedimento estabelecido de Lutz et ai ⁶ e é capaz de gerar 5 -. 10 X 10 ⁶ células não aderentes no dia 7 de uma cultura de 10 ml. A cultura é utilizável a partir de 7 a 10 dias e produz uma população heterogénea de macrófagos, DC imaturas e maduras, bem como alguns progenitores no dia 7. Isto proporciona um método simples para isolar e cultivar in vitro macrófagos alveolares semelhantes em grandes quantidades.