Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
I macrofagi e le cellule dendritiche (DC) sono cellule immunitarie innate trovati nei tessuti e negli organi linfoidi che giocano un ruolo chiave nella difesa contro gli agenti patogeni. Tuttavia, essi sono difficili da isolare in numero sufficiente per studiarli in dettaglio, di conseguenza, sono stati sviluppati modelli in vitro. In vitro culture di osso macrofagi derivate dal midollo e cellule dendritiche sono metodi di valore ben consolidati e per gli studi immunologici. Qui, un metodo per la coltura e l'identificazione sia DC e macrofagi da una sola coltura di cellule del midollo osseo principale del mouse utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi citochina (GM-CSF) è descritto. Questo protocollo si basa sulla procedura stabilita prima sviluppato da Lutz et al. nel 1999 per l'osso DC derivate dal midollo. La cultura è eterogenea, e MHCII e acido ialuronico fluoresceinato (FL-HA) sono utilizzati per distinguere i macrofagi da DC immature e mature. Questi GM-CSF derivato macrofagi provide una comoda fonte di in vitro macrofagi derivati che ricordano da vicino macrofagi alveolari sia in fenotipo e la funzione.
Introduction
Diversi metodi in vitro di coltura sono stati descritti per generare osso macrofagi derivate dal midollo (BMDMs) e DC derivate dal midollo osseo (BMDCs) utilizzando uno o una combinazione di fattori di crescita. BMDMs può essere generato da coltura di cellule di midollo osseo utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Per BMDCs, l'aggiunta di FLT3 ligando alla cultura midollo osseo comporta non aderenti DC classici e plasmacitoidi (alta CD11c / MHCII alta e CD11c lo, B220 + rispettivamente) dopo 9 giorni di coltura 3,4. Al contrario, le cellule non aderenti generati dopo 7 a 10 giorni in coltura con solo GM-CSF 5,6, GM-CSF e IL-4 7, o GM-CSF e FLT3 ligando 8,9 generano BMDCs più da vicino assomiglia DC infiammatorie (alta CD11c, MHCII alta CD11b +) 10. Mentre queste colture in vitro sono utilizzati per generare macrofagi oDC, non è chiaro se ogni cultura dà luogo a popolazioni puri. Ad esempio, anche se le cellule aderenti nelle colture GM-CSF sono descritti come macrofagi 5, le cellule non aderenti dalla stessa cultura vengono utilizzati come DCS 6,11-13, con la presunzione che sono omogenei e ogni variabilità osservata è a causa di diversi stadi di sviluppo 14,15. Inoltre, gli studi hanno trovato GM-CSF di essere un fattore di crescita essenziale per lo sviluppo dei macrofagi alveolari in vivo 16,17, e può essere impiegato in vitro per generare macrofagi alveolari simile 16,17,18.
Oltre aderenza, le procedure per la generazione di macrofagi e cellule dendritiche da GM-CSF trattata colture di midollo osseo sono molto simili suggerendo eterogeneità possono esistere all'interno di GM-CSF colture di midollo osseo. Questo sembra davvero essere il caso come due documenti segnalare la presenza di BMDMs nella frazione non aderente di culture BMDC. In un articolo, che identified una popolazione di cellule come CD11c +, CD11b +, MHCII metà, MerTK + e CD115 +, che ha espresso una firma espressione genica che più assomigliava macrofagi alveolari e aveva una ridotta capacità di attivare le cellule T 19. La seconda carta utilizzata MHCII e FL-HA per identificare una popolazione macrofago-come alveolare (CD11c +, MHCII medio / basso, FL-HA alto), che è stato distinto da immaturi (CD11c +, MHCII metà, FL-HA basso) e maturo DC (CD11c +, MHCII alto), sia fenotipicamente e funzionalmente 18. Queste carte entrambe illustrano che le culture GM-CSF BMDC sono eterogenei, contenente sia macrofagi e le popolazioni DC che indicano che si deve prestare attenzione quando si interpretano i dati provenienti da culture BMDC.
Questo protocollo descrive come isolare il midollo osseo, cellule del midollo cultura ossee in GM-CSF, e identificare il alveolari macrofago-likepopolazione dalle DC immature e mature nella cultura midollo osseo di citometria a flusso utilizzando FL-HA vincolante e di espressione MHCII. Questa procedura è basata sulla procedura stabilita Lutz et al 6 ed è in grado di generare 5 -. 10 x 10 6 cellule non aderenti il giorno 7 di una cultura 10 ml. La cultura è utilizzabile da 7 a 10 giorni e produce una popolazione eterogenea di macrofagi, cellule dendritiche immature e mature, così come alcuni progenitori al giorno 7. Questo fornisce un metodo semplice per crescere e isolare in vitro macrofagi alveolari simili in grandi quantità.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, forniamo un metodo per generare macrofagi e cellule dendritiche GM-CSF derivati da una singola coltura di midollo osseo di topo che è adattato da Lutz et al. 6. Espressione MHCII e FL-HA distingue tra DC immature e macrofagi vincolante in questa cultura (vedi Figura 3C), che in precedenza è stato difficile. Questo, insieme con un altro rapporto da Helft et al. 19, dimostra l'eterogeneità all'interno di GM-CSF culture BMDC in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119503) e le scienze e ingegneria Consiglio Naturale del Canada (NSERC). NSERC supportato anche borse di studio estive per YD e AA YD è sostenuto dalla University of British Columbia (UBC), con un premio borsa di studio di 4 anni, AA è supportato da CIHR con il premio di Master studente laureato (CGS-M). Ringraziamo Calvin Roskelley per l'assistenza con il microscopio utilizzato per generare le immagini nella Figura 2. Riconosciamo inoltre sostegno da parte dei UBC animali e citometria a flusso strutture.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
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