Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Mehrere in vitro Kulturverfahren beschrieben wurden Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark stammenden DCs (BMDCs) unter Verwendung eines oder einer Kombination von Wachstumsfaktoren zu erzeugen. BMDMs kann durch Züchten Knochenmarkszellen erzeugt werden unter Verwendung von entweder Makrophagen – Kolonie – stimulierender Faktor (M-CSF) oder GM-CSF ^1,2. Für BMDCs gibt die Zugabe von FLT3 – Ligand an der Knochenmarkkultur zu nicht-haft klassischen und plasmazytoiden DCs (CD11c ^hoch / MHCII ^hoch und CD11c ^lo, B220 ⁺ beziehungsweise) nach 9 Tagen in Kultur ^3,4. Im Gegensatz dazu nicht adhärenten nach 7 bis 10 Tagen in Kultur erzeugt Zellen mit GM-CSF allein ^5,6, GM-CSF und IL-4 ⁷ oder GM-CSF und FLT3 – Ligand ^8,9 erzeugen BMDCs mehr ähnelt entzündliche DCs (CD11c ^hoch, MHCII ^hohe CD11b ^{+) 10.} Obwohl diese in vitro Kulturen werden verwendet , Makrophagen zu erzeugen oderDCs, es ist unklar, ob jede Kultur Anlass zu reinen Populationen gibt. Obwohl beispielsweise adhärente Zellen in den GM-CSF – Kulturen beschrieben Makrophagen ^5, die nicht-adhärenten Zellen aus der gleichen Kultur zu sein als DCs ^6,11-13, mit der Annahme verwendet , dass sie homogen und jede beobachtete Variabilität sind, aufgrund unterschiedlicher Entwicklungsstadien ^14,15. Darüber hinaus haben Studien GM-CSF in vivo gefunden ^16,17, ein wesentlicher Wachstumsfaktor für Alveolarmakrophagen Entwicklung zu sein und kann in vitro verwendet werden alveolären Makrophagen-ähnliche ^16,17,18 zu erzeugen.

Anders als die Einhaltung sind die Verfahren für Makrophagen und DCs von GM-CSF behandelt Knochenmarkkulturen zu erzeugen sehr ähnliche Heterogenität was darauf hindeutet, innerhalb GM-CSF Knochenmarkkulturen existieren können. Dies scheint auch der Fall zu sein, da zwei Papiere des Vorhandenseins von BMDMs in der nicht-haftenden Fraktion von BMDC Kulturen berichten. In einem Papier, sie identified eine Population von Zellen CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^mid, MerTK ⁺ und CD115 ^+, der eine Genexpression Signatur ausgedrückt, die am ehesten Alveolarmakrophagen und hatte eine reduzierte Fähigkeit glich zu aktivieren ¹⁹ T – Zellen. Das zweite Papier verwendet MHCII und FL-HA eine Alveolarmakrophage artigen Population (CD11c ^+, MHCII ^{mid / niedrig,} FL-HA ^hoch) zu identifizieren , die von unreifen (CD11c ^+, MHCII ^Mitte, FL-HA ^niedrig) und reifen unterschied DCs (CD11c ^+, MHCII ^hoch), die beide phänotypisch und funktionell ^18. Diese Papiere zeigen beide, dass GM-CSF BMDC Kulturen heterogen sind, sowohl Makrophagen und DC-Populationen enthalten, die Versorgung angibt, sollten getroffen werden, wenn Daten aus BMDC Kulturen zu interpretieren.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Knochenmark, Kultur Knochenmarkzellen in-GM-CSF zu isolieren und zu identifizieren, die Alveolarmakrophage artigenBindung und MHCII Ausdruck Bevölkerung aus den unreifen und reifen DCs im Knochenmarkkultur mittels Durchflusszytometrie FL-HA verwenden. Dieses Verfahren wird auf dem etablierten Verfahren von Lutz et al basierend ⁶ und 5 in der Lage , zu erzeugen -. 10 x 10 ⁶ nicht-adhärenten Zellen am Tag 7 einer 10 ml Kultur. Die Kultur ist verwendbar von den Tagen 7 bis 10 und ergibt eine heterogene Population von Makrophagen, unreifen und reifen DCs, sowie einige Progenitoren am Tag 7. Dies stellt eine einfache Methode zu wachsen und in vitro alveolären Makrophagen-ähnliche in großen Mengen zu isolieren.