Kappa (VK) için Antikor Bağlama Özgünlük Hafif Zincir içeren İnsan (IgM) Antikorlar: Polysialic Asit (PSA) bir Vaka Çalışması olarak NCAM Bağlı

Hayvan protokolleri ve prosedürleri Sağlık kılavuzların National Institutes göre yapılan ve Mayo Clinic kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri (Mayo IACUC protokol numarası # A51912) tarafından onaylanmıştır. 1. Genel CNS Doku Hazırlanması heterozigot geçerek, heterozigot NCAM fareler ve yabani tip (WT) littermates (C57 / BL6) (nazikçe Dr Lynn Landmesser, Case Western Reserve Üniversitesi, Cleveland, Ohio tarafından sağlanan) C57 / BL6 arka plan üzerinde NCAM eksik (KO) fareler oluşturun. NCAM KO farelerde Genotipleme önce 32-34 tarif edilmiş ve daha ayrıntılı olarak açıklanmayacaktır. Not: 1.2 Adımları – 1.6 İsteğe bulunmaktadır. Ameliyat öncesinde, bir pentobarbital çözeltiyi uygulamaya (Hazır: 25 mg / ml; erken doğum sonrası ilgili erginleri için pentobarbital 50/100 ul) periton içine enjekte (27 gauge iğne ve 1 ml ileşırınga). 2 dakika bekleyin ya da hayvanın kadar anestezi cerrahi uçağı ulaşmıştır. anestezi cerrahi düzlemi korumak için, her operasyon esnasında gerekli olduğu şekilde ek anestezisi uygular. Anestezi derinliğini belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanın. Hayvanlar devam etmeden önce tepkisiz olmalıdır. sadece göğüs kafesine altında kabuklarıyla ve karın duvarından 1 cm lateral insizyon – 0.5 yapın. Dikkatle diyaframdan karaciğeri ayırın. kavisli, künt makas kullanarak diyafram küçük bir kesi yapmak. plevra boşluğuna maruz göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyafram kesi devam edin. dikkatle akciğerleri yerinden, göğüs kafesinin bir tarafı boyunca eğri, künt makas yerleştirin ve köprücük kemiği ile göğüs kafesinin kadar içinden bir kesim yapmak. karşı tarafta da benzer bir kesim olun. uzakta sternum Kaldırma dikkatlice kalp bağlayarak herhangi bir dokuyu kırpın. hayvana bir kesi yapmak'Mümkün olduğunca geniş bir çıkış oluşturmak için iris makas kullanarak sağ atrium s. Yavaş yavaş hayvanın sol ventrikül içine, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 10 ml enjekte (kırmızı ışık, akış hızı: 1 mL / dakika) ile 27 ölçü iğne ile donatılmış 10 ml'lik bir şırınga ile. doku yıkımını önlemek için perfüzyon sırasında basınç / PBS akışını artırmak etmeyin. cerrahi makas kullanarak neonatal fareler başını kesmek. Bir forseps ile göz yuvalarını kapma ve omurga içine küçük bir makas sokarak beyin çıkarın. kulak seviyesinde öne doğru kafatası kesti. Soyma geri kafatası ve yavaşça buz üzerine buz soğukluğunda kesme ortamı 10 ml (Tablo 1) ile dolu bir 60 mm Petri kabı içine beyin yerleştirin. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde her beyin yerleştirin ve hemen kuru buz üzerinde saklamak (-79 ºC). buz üzerinde temiz bir jilet kullanarak dondurulmuş beyninden beyincik ve beyin sapı İnsizyon. doku çözdürme önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. tartmakDondurulmuş beyin, buz üzerinde 15 ml tüp içinde koymak ve ul liziz tamponu 150 ug beyin dokusu nihai konsantrasyona kadar buz soğukluğunda lizis tamponu (Tablo 1 e bakınız) ilave edilir. Cerebra'ya kalan için tekrarlayın. adımlar 1.9 için her zaman buz üzerinde beyinleri tutun – 1.11. 27-gauge iğne (10 kez) ile donatılmış bir 5 ml şırıngaya ile toz haline getirildi, 1 ml pipet ucu (10 kez) ile toz haline getirilerek liziz tamponunda beyinleri homojenize edilir. tam doku lizis izin vermek için buz üzerinde 30 dakika daha beyin lizatları inkübe edin. (4 ° C'de 10 dakika boyunca 19,000 x g'de dört kez) deterjan çözünmeyen malzeme ve beyin seri santrifüjleme yoluyla lipidler çıkarın. Sil (beyaz) miyelin ve pelet içeren hücre döküntüsü ama her bir santrifüj aşamasında sonra süpernatant saklayın. Kısım beyin lizatları ve mağaza -80 ºC de. Cerebra bir "Pull-down" Ajan İnsan IGMS (HIgM12 ve İzotip Kontrol IgM) kullanma 2. imünoWT l lizatlarında ve NCAM KO Farelerinde Protein L Agaroz boncuk hazırlama 9,35,36 BSA (Tablo 1 e bakınız) dahil olmak üzere, bir IP tampon maddesi 200 ml hazırlayın. BSA içermeyen aynı IP tampon maddesi bir 200 ml hazırlayın. immünopresipitasyon reaksiyonu transferi 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine 200 ul pipet kullanarak protein L Agaroz bulamaç 100 ul başına. vorteks proteini L agaroz boncuklar yapın! IP tampon maddesi 1 ml ilave edilir, her bir tüp (Tablo 1 e bakınız). Protein L agaroz ve inversiyon aracılığıyla elle IP tampon (beş kez) karıştırın. bir tezgah üstü santrifüj içinde yıkayın proteini L agaroz taneleri santrifüjleme ile dört kez (1.000 x g, 2 dakika, 25 ° C). Agaroz pelet bozmadan 200 ul pipet kullanarak süpernatant çıkar. Tekrarlama yıkama 2.1.2 üç 2.1.3 ilave kez yineleyin. 4 ° C'de gece boyunca bir silindir üzerine taze eklenen IP tampon maddesi 1 ml Protein L agaroz dengelenmesi. Western lekeleme, antikor-antijen-agaroz L kompleks oluşumu ve antijen tespit 4 ° C'de, bir silindir üzerinde bir gece boyunca, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde IgM antikoru (HIgM12) 20 ug buz soğukluğunda bir IP tampon maddesi 1 ml liz beyin dokusunda (~ 200 ul lizat) 30 mg inkübe edin. 1000 xg, 4 ° C'de 2 dakika süreyle bir tezgah üstü santrifüj içinde (adım 2.1.4 itibaren) Protein L agaroz boncuk aşağı doğru döndürün. Agaroz pelet bozmadan 200 ul pipet kullanarak süpernatant atın. 1 ml pipet kullanılarak protein L agaroza (adım 2.2.1 arasında) soğutulmuş bir antikor-beyin lizat solüsyonu ekleyin. 4 ° C'de, bir silindir üzerinde 2 saat için antikor-antijen proteini L agaroz süspansiyon inkübe edin. 2 dakika, 4 ° C '1000 xg'de santrifüjleme ile L agaroz bağlı antikor-antijen kompleksinin yıkayın. Dikkatlice pelet bozmadan süpernatan atılır ve% 0.2 BSA ihtiva eden buzla soğutulmuş bir IP tampon maddesi 1 ml. % 0.2 BSA ve BSA olmayan buz soğukluğunda bir IP tamponu kullanılarak iki kez daha ihtiva eden buzla soğutulmuş bir IP tamponu kullanılarak yıkama aşamasından, bir kez daha tekrarlayın. 2 dakika, 4 ºC 1000 xg'de L agaroz bağlı antikor-antijen kompleksi aşağı doğru döndürün. Tamamen birinci çözelti, 50 ul, 10 ul pipet ardından Protein L agaroz pelet üzerine bırakılır ~ kadar 200 ul pipet kullanarak süpernatant atılır. buz üzerinde örnekleri tutun. IP elüsyon tamponu 40 ul ekle 95 ° C 'de 5 dakika boyunca 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri, parmakla hafifçe vurma tüpler 6 kez ve ısı başı (Tablo 1 e bakınız). 2 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri koyun ve 13.000 xg, 4 ° C'de 30 saniye boyunca aşağı doğru döndürün. pelet bozmadan yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine 10 ul pipet (~ 35 ul toplam) kullanarak süpernatant aktarın. İç boru duvarında edilen örnek bir miktar aşağı doğru durulama ile protein L agaroz boncuklar yokluğunu onaylamak. Not: "Granül"Protein L agaroz boncuklar açıkça varsa görebilir. Protein L agaroz boncuklar varsa, 13.000 xg'de bir 30 saniye örnek aşağı spin ve tüp temizlemek için süpernatant aktarın. Hiçbir agaroz boncuklar saptanabilir kadar adımı tekrarlayın. Yük 10 – bir Tris / glisin / SDS tampon sisteminde, SDS-poliakrilamid jeli üzerinde oyuk başına yıkandı, örnekleri 20 ul (Tablo 1 e bakınız). Not: – 8.6 x 6.7 x 0.1 cm) kullanın% 7.5 ya da 4 PSA-NCAM veya NCAM izoformlarının (jel boyutları (G x U x kalınlık tespiti için kuyu başına 50 ul yükleme hacmi ile% 20 gradyan jelleri. Masa üstü 100 V de yaklaşık 1 saat boyunca çalıştırmak jeller (1.74 U / cm2). Diğer ferahlatıcı Bu aşamada 37,38 için gerekli değildir. PVDF transfer proteinlerinin (poliviniliden florür) membran soğuk transfer tamponu kullanılarak 100 V de soğuk bir odada 2.5 saat (1.74 U / cm2) için (gözenek boyutu 0.45 um) (5-10 ° C) (Tablo 1 e bakınız). Blok membranlar wi,% 10 (ağırlık / hacim), bir tezgah üstü orbital çalkalayıcı üzerinde 25 ° C'de 1 saat süre ile, PBS-T içinde kuru süt tozu, PBS içinde% 5 BSA birincil antikor ile bir gece boyunca 10 PBS-T ile dakika ve prob iki kez membranları yıkamak soğuk oda bir orbital çalkalayıcıda t. 25 ° C'de kısa bir süre fazla PBS-T ile ertesi sabah, yıkama membranlar bir kez 10 dakika orbital bir karıştırıcı üzerinde her biri (80 rpm) PBS-T ile 3 kez yıkanmasından sonra (kapak ve kap içerir) (Bütün yıkama adımları 25 gerçekleştirilir ºC). İkincil antikor ekleyin (yaban turpu peroksidaz (HRP) HIgM12 anti-insan anti-IgM antikoru () (seyreltme 1 ile konjüge edilmiş: bir orbital çalkalayıcı üzerinde 25 ° C'de 1 saat süreyle, PBS-T içinde% 5 kuru süt tozu 30.000) (70 rpm ). Yıkama zarların 25 ° C'de kısa bir süre fazla PBS-T ile bir kez 10 dakika orbital bir karıştırıcı üzerinde her biri (80 rpm) PBS-T ile 3 kez yıkanmasından sonra (kapak ve kap içerir) (Bütün yıkama adımları 25 ° C'de gerçekleştirilir) . soğutulmuş geliştirilmiş chemiluminescen 1 ml karıştırın25 ° C'de (mini blot başına) B bileşeni (Oksitleyici reaktif), 1 ml CE HRP substratı bileşen A (Luminol reaktifi). (Çok kenarlarında tutunuz) fazla sıvıyı çıkarmak için bir kağıt havlu üzerine membranlar aktarmak için plastik forseps kullanabilir. geri kaplara kağıt havlu ve koyun membran ile kuru konteynerler (her membranın için bir tane). Hemen, her membran önceden karıştırılmış zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma HRP alt-tabaka (bileşik A + B) (aşama 2.2.16.) 2 ml ilave edilir ve bir orbital çalkalayıcı (90 rpm) 25 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin. Emin olun membranlar eşit kimyasal parıltı maddesi ile nemlendirilir. şeffaf plastik kovan içine aktarın membranlar ve kağıt havlu ile fazla sıvı ve hava kabarcıkları. Bir film kaseti plastik kovan içinde membranlar koyun ve sonunda kasete plastik kol bantlayın. Kaseti kapatın. Karanlık içine kaset, film zamanlayıcı ve makas alın. Her fi sağ üst köşesinde kestioryantasyon amaçlı lm, farklı zaman aralıklarında için (farklı) filmleri (10 sn, 1 dk, 10 dk) ortaya çıkarmak ve film geliştirici filmleri gelişir. NCAM 39 ekinde PSA 3. Endoneuraminidase-NF Sindirim Tablo 2'de 39 de gösterildiği gibi, doğum sonrası gün (P) 7 ağırlık fareler ve P7 NCAM KO farelerden Özet lize beyin dokusu endoneuraminidase-NF (endo-NF) kullanılarak buz üzerinde 2 saat boyunca (adım 1.12 hazırlanabilir). Aşama 3,1 (Tablo 2) – Her bir boru (6 1), 4x Laemmli numune tampon maddesi 5 ul ekle. 4 yük örnekleri -% 20 gradyan SDS-poliakrilamid jel ve tekrar 2.2.19 için 2.2.10 adımları. PBS içinde% 5 BSA HIgM12 (1 ug / ml), ticari olarak temin edilebilen bir anti-PSA mAb (klon 2-2B) (1 ug / ml) ve β-aktin antikoru (yükleme kontrolü) (1 ug / ml) ile tarama sistemi membranları -T. Rat ve Fare MSS Kültürler 4. hazırlanması <strong> Cam lameller hazırlanması Cam kap kullanılarak bir duman başlığı içinde, 16 saat – 4 – 60 ° C 50 1 M HCI asitle yıkama 25 mm'lik cam lamelleri. zaman Hafifçe girdapladıktan ile lamelleri çalkalayın. Yıkama cam yoğun damıtılmış su (3x) lamelleri. yığılmış lamelleri arasında asit yıkamak için emin olun. % 100 etanol içinde lamelleri durulayın ve bir hücre kültürü kaputu Parafilm onları kurutun. Bir gün kullanılmadan önce, bir fırın içinde 100 ° C 'de kapaklı bir cam kap içinde 24 saat için cam lamelleri ısıtın. 37 ° C 'de 1 saat süre ile, steril su içinde 40 ug / ml poli-D-lizin, 3 ml 6 oyuklu çanağı ve kat cam lameller koyun. Steril su ile iki kez yıkanır, hücre kültürü başlık altında tamamen kurumasını ve 20 dakika, UV ışığı uygulanır. CNS Hücreleri için Doku Kültürü Plastik Hazırlanması 3 ile kaplayın 60 mm hücre kültürü yemekleri ya da 75 cm 2 doku kültürü şişeleriml veya 10 ml olarak, 37 ° C 'de 1 saat süre ile, steril su içinde / ml poli-D-lizin 40 ug. Iki kez su ile yıkama, hücre kültürü başlık altında tamamen kurumasını ve 20 dakika, UV ışığı uygulanır. Sıçan karışık Glia İzolasyon 40 IACUC CO 2 gaz kaynağı (tam otomatize) ile kemirgen ötenazi odasını onaylı yenidoğan sıçan anestezisi. Hayvanın yanıtsızlık belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanın. (- Bir seferde 10 yavru 6) yenidoğan Sprague Dawley sıçan (P0P1) başını kesmek. Bir forseps ile göz yuvalarını kapma ve omurga içine küçük bir makas sokarak beyin çıkarın. kulak seviyesinde öne doğru kafatası kesti. Soyma geri kafatası ve yavaşça (Tablo 1 e bakınız), buz üzerinde buz soğukluğunda kesme ortamı 10 ml ile dolu bir 60 mm Petri kabı içine beyin yerleştirin. (- 10 yavrular 6) sıçan yavrular kalan için tekrarlayın. 4.3.7 – adımlar 4.3.2 için buz üzerinde doku tutun. </li> İki beyin hemisfer içine orta hat boyunca beyni bölmek ve daha sonra koku ampuller, bazal serebral korteks altındaki ganglionlar ve Dumont forseps ile hipokampus kesti. Buz üzerinde orta diseksiyon içeren temiz bir Petri kabındaki izole serebral korteks yerleştirin. bir korteksi alın. Bir diseksiyon mikroskobu altında ince ipuçları ile forseps ile meninks çıkarın. Kalan korteks ile tekrarlayın. buz üzerinde bir temiz Petri kabı içine tüm zarları serbest korteks yerleştirin. 60 mm Petri kabındaki tüm yavruların kortikal hemisferlerin birleştirin ve parçaları kıyılmış 1 mm içine beyin dokusunun zar steril bir jilet kullanın. steril, kaplanmamış 500 mililitrelik bir cam kabın içine 10 ml pipet kullanılarak kıyılmış beyin dokusu aktarın ve sıçan beyin başına buz soğukluğunda kesme ortamı 10 ml. Sıçan beyin başına HBSS 9 ml HBSS (Hank dengeli tuz çözeltisi) (5 mg / ml tripsin) tripsin çözeltisinin 1 ml eklenirken yavaşça şişeyi girdap. 2 ekleDNaz I çözeltisi (1 mg / ml) ve MgSO 4 çözelti içinde toplam hacminin% 2 toplam hacminin% (HBSS% 3.82 MgSO 4 (a / h)), beyin dokusu süspansiyonuna yavaşça girdap. 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir dönme çalkalayıcıda nazik çalkalama altında Trypsinize dokusudur. Emin doku parçaları bu adımı sırasında yüzen ve alt tortu yok olun. Gerekirse hızını dönen artırın. % 10 (h / h) nihai konsantrasyona kadar fetal sığır serumu (FBS) ilave edin ve 10 sn için şişeye 10 kez dönen karıştırılır. 15 dakika boyunca buzlu su içinde doku süspansiyonu soğutun. Girdap yavaşça beş kez her saniye min şişeyi. Yavaşça 200 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 25 ml, 50 mi pipetler ve santrifüj kullanılarak steril bir 50 ml tüp içine doku süspansiyonu aktarın. , 0.4 mi MgSO 4 çözeltisi Süpernatant atılır ve yavaşça 15 fetal sığır serumu, 5 ml ile takviye edilmiş buz soğukluğunda kesme ortamının ml dijeste CNS doku tekrar süspansiyon (% 3.82HBSS MgSO 4) olarak ve DNase I (1 mg / mi) 1.6 mi. iki steril 15 ml tüpler içinde eşit bölünmüş doku süspansiyonu (~ 10 mL) ekstrakte edildi ve yavaş yavaş süspansiyon, bulanık / sütlü hale gelene kadar, 10 ml bir pipet (10 kez) ile toz haline getirin. Bir sonraki tüp işlenirken buz üzerinde asılı hücreleri tutun. sindirilmiş MSS kalan tüpün dibine tortu dokular kadar 3 dakika bekleyin. Aktarım süpernatant pelet fraksiyonu bozmadan 50 ml tüp temizlemek için. İsteğe bağlı olarak, 40 mikron hücre süzgecinden bulanık süpernatantlar geçmek ve buz üzerinde steril 50 ml tüpler içine sonuçlanan tek bir hücre süspansiyonu birleştirir. 200 xg, 4 ° C'de 5 dakika boyunca hücre bulamaç Spin. orta diseksiyon ~ 2 ml hücre pelet üstünde kalana kadar yavaşça 10 ml pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. 50 ml tüpler (~ 10 kat) hafifçe vurun hücre topakları. Yavaş yavaş ısınmaya büyüme ortamı 5 mL hücre süspansiyonu hafifçe (Tablo 1 e bakınız)El tüpü dönen. İsteğe bağlı olarak, görünür doku kümeleri ya da DNA kümeleri halinde açık DNaz I çözeltisi ve MgSO 4 solüsyonunun buz üzerinde bir 10 dakika daha DNaz adımı 4.3.12 tekrarlayın. Girdap tüp elle 5 kez her saniye dk. Levha 50,000 6 oyuklu tabakta 400 ul büyüme ortamında bir su birikintisi 25 mm cam lamel ortalama hücre ve hücreler, bir hücre kültürü inkübatöründe (% 5 CO2, 37 ° C) 'de 30 dakika süreyle tutunma sağlar. Konfluent (24 içinde – 48 kaplama sonrası saat) 60 mm hücre kültürü yemekleri ve 75 cm 2 doku kültürü şişeleri, plaka 500.000 hücreleri (60 mm çanak) ya da 2 milyon hücre (75 cm 2 şişeler). Yavaşça 2 ml ekleyin (göz başına 25 mm cam lamelleri 6-çukurlu tabak), 3 ml (60 mm tabaklar) ya da her bir sıcak büyüme ortamında 10 ml (75 cm 2 şişe) de. bir gecede inkübe hücreleri ve ertesi sabah orta tamamen değişir. Sonra orta her gün (vb 3. gün, günde 5 gün 7) değiştirin. Yok hayırte: – 48 saat sonra kaplama Sıçan karışık glia kültürleri 24 immünsitokimya veya biyokimya için kullanıma hazırdır. Fare Karışık Glial Kültürleri 4.3.1 4.3.6 için bölümlerde açıklanan yenidoğan sıçan beyinlerinde diseksiyonu, C57 / BL6 arka plan ile P0 yenidoğan WT ve NCAM KO fareler başını kesmek beyinleri kaldırmak ve buz diseksiyon orta onları koymak için Özdeş (bakınız Tablo 1). her zaman buz üzerinde doku tutun. İki beyin hemisfer içine orta hat boyunca beyni bölmek ve daha sonra koku ampuller, bazal serebral korteks altındaki ganglionlar ve Dumont forseps ile hipokampus kesti. buz üzerinde HBSS içeren temiz bir Petri kabındaki izole serebral korteks yerleştirin. bir korteksi alın. Bir diseksiyon mikroskobu altında ince ipuçları ile forseps ile meninks çıkarın. Kalan korteks ile tekrarlayın. buz üzerinde bir temiz Petri kabı içine tüm zarları serbest korteks yerleştirin. kortikal hemisphe aktarınAyrı, steril 15 ml tüpler içinde her fareden 1 mi pipetle Res. Her beyne 1.2 ml buz gibi soğuk diseksiyon orta ekleyin ve mekanik kadar o 2 kez pipetleme ve 1 ml pipet kullanarak aşağı beyin dokusunu bozar. 150 ul papain çözeltisi (PBS içerisinde 10 mg / ml), 100 ul DNaz I çözeltisi (HBSS içindeki 1 mg / ml) ve her bir beyin için 50 ul MgSO 4 (HBSS% 3.82) ilave edin ve parmak hafifçe vurarak karıştırın. su banyosunda 37 ºC 'de 30 dakika boyunca beyin süspansiyonu inkübe ve beyin süspansiyonlar parmak Flicking tarafından her saniye dakika karıştırın. , Tüp başına FBS 1 ml ilave edilir karıştırın ve buz üzerinde 10 dakika boyunca doku süspansiyonu soğutmak. 200 xg, 4 ° C'de 4 dakika için beyin dokusu Spin ve MgSO DNaz I çözeltisinin 70 ul (1 mg / HBSS mi) ve 30 ul desteklenmiş buz soğukluğunda kesme tamponu 1 ml 4 çözeltisi, doku pelletini (HBSS 3.82%). Bir kullanarak beyin dokusuna çiğnemek FBS kaplı 1 ml pipet(~ 5 kez) yüzer bulanık hale gelinceye kadar. 40 mikron hücre süzgecinden süpernatant Pass ve buz üzerinde temiz bir tüp içine aktarın. 200 xg, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj ile karıştırılır glial hücreler pelet. ortamın aspire yüzer 100 ul kadar ul hücre peleti üstüne bırakılır. Parmakla kaydırma (~ 5 kez) ve sıcak bir fare büyüme ortamı 1 ml ilave ile yeniden süspanse hücre topağı (Tablo 1 e bakınız). İsteğe bağlı olarak, görünür hücre kümeleri ve parçalanmış hücreleri çözülür / yavaşça aşağı hücre süspansiyonu yukarı ve (beş kez) pipetleme DNA çöktürülmüş. 4.3.21 – PDL-kaplı cam lamelleri ya da 60 mm yemekleri plaka fare karışık glial hücreler adımlarda 4.3.19 açıklandığı gibi. Sıcak fare büyüme ortamı ve daha sonra her gün ertesi sabah hücreleri yıkayın. kaplama 72 saat sonra – Fare karışık glia immünsitokimya 48 kullanıma hazırdır. Sıçan Mikroglia İzolasyon Kültür sıçan karışıkbüyüme ortamında 75 cm2 doku kültürü şişelerinde glia 10 gün boyunca (bakınız Tablo 1). 1 saat süre ile 140 rpm'de bir hücre kültürü inkübatöründe (% 5 CO2, 37 ° C) içinde döner bir karıştırıcı üzerinde karışık glial kültürlerden mikroglial hücre kümeleri devre çalkalayın. Karışık glia kültürlerinden mikroglia-ihtiva eden üst sıvıyı çıkarın 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçmek ve steril 50 ml tüpler içinde bir hücre süspansiyonu tutun. Not: Mikroglial kültürler az kirletici OPC ve çok az astrositler ile bu aşamadan sonra tipik olarak>% 95 saf. İsteğe bağlı olarak, gelecekte mikroglial sallamak-off için karışık glia kültürleri üzerinde büyüme orta yerine. Genellikle karışık glial kültürlerden (haftada) birden mikroglial sarsıntı-off gerçekleştirin. İsteğe bağlı olarak, saflık% 95 daha yüksek bir plaka, 100 mm Petri kaplarına göre mikroglia içeren süpernatan (aşama 4.5.2) 10 ml alma ve 37 ° C 'de, 30 dakika için bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edilmesi. Sadece microglastrositler ve OPC süpernatant kalırken ia, Petri eklenecektir. Yavaşça saat yönünde ve saat yönünün tersine hücre kültürü kaputu (beş kez her biri) Petri kapları sallayın. Aspire hücre kültürü ortamı tam ve büyüme ortamına, 10 ml ile değiştirin. Ortaya çıkan mikroglia kültürleri% 98 saf> vardır. DMEM içinde 7 gün boyunca kültür mikroglia% 1 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. Sıçan OPC / oligodendrosit İzolasyon Zenginleştirilmiş OPC kültürleri 1 saat süre ile 140 rpm'de bir hücre kültürü inkübatöründe (% 5 CO2, 37 ° C) olan bir döner çalkalayıcı üzerinde 75 cm2 şişelerde büyüme 10 günlük karışık glial kültürlerden ilk mikroglial hücreleri sıyrılarak elde etmek için. mikroglia sadece içeren süpernatant atın veya mikroglia özel deneyler (adım 5.5) için kullanın. 10 ml büyüme ortamı ile mikrogliyal içeren süpernatant değiştirin ve karışık glial kültürlerin silkeleyin200 rpm'de (% 5 CO2, 37 ° C) bir dönme çalkalayıcıda 18 saat daha. Karışık glia kültürlerinden microglia- ve OPC içeren süpernatant toplayın ve 40 mikron hücre süzgecinden geçer. steril 50 ml tüplerde hücre süspansiyonu toplanır. İsteğe bağlı olarak, gelecekte OPC shake-off için karışık glia kültürleri üzerinde büyüme orta yerine. Not: OPC düşük verim ile de olsa, astrositik besleyici katmanlar üzerinde çoğalmaya devam eder ve sarsılmış-off olabilir ikinci ve üçüncü kez (haftada). Levha microglia- 100 mm Petri kaplarına süpernatan OPC ihtiva eden ve 37 ° C 'de 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöründe inkübe 10 mi. OPC ve astrositler süpernatant kalırken mikroglia, Petri eklenecektir. Yavaşça saat yönünde ve saat yönünün tersine bir hücre kültürü kaputu (5 kez her) Petri kapları sallayın. Hücre kültürü inkübatör bir seferde sadece bir kaç Petri kapları çıkartın (mikroglia Pet itibaren yerinden oynatmamaya başlayacaksoğutucu ortamda iyice çalkalanır ri yemekler). Toplamak ve 50 ml'lik tüplere OPC-ihtiva eden üst sıvıyı birleştirir. İsteğe bağlı olarak, mikroglia özgü deneylerde kullanılmak üzere Petri tabaklarına kültür ortamı ilave edin. İsteğe bağlı olarak, daha da OPC preparatlarda mikroglia ölçüde düşürmek için taze Petri kapları ile bir kez adımları 5.6.5 ve 5.6.6 tekrar OPC kültürleri saflığını geliştirmek için. 250 xg, 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj zenginleştirilmiş OPC içeren süpernatant aşağı doğru döndürün. Yavaşça hücre pelletini bozmadan süpernatant aspire. pelet üzerine yüzer 3 ml boş ve parmakla kaydırma (10 kez) OPC yeniden süspanse başlar. (- 10 kez 5), 10 ml bir pipet kullanarak yavaşça çiğnemek OPC hücre kümeleri. Hücre sayımı ve 6 oyuklu tabakta 400 ul büyüme ortamında bir su birikintisi 25 mm cam lamel (PDL kaplı) başına 50.000 OPC plaka ve hücreler, bir hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika süreyle tutunma sağlar (% 5 CO2, 376 ° C). Yavaşça her bir sıcak proliferasyon ortamında (bakınız Tablo 1) 2 ml ekleyin. proliferasyon ortam 3 ml 1.500.000 OPC – 60 mm'lik bir hücre kültür kaplarına, levha 1 PDL kaplanabilir. Dikkatle OPC kaplama sonrası taze çoğalması ortamı 3 saat ile çoğalma ortamı FBS içeren replace (düzgün takılı emin OPC olun ve orta değişimi sırasında yerinden etmeyin). Değişim orta ikinci günde. Not: Sıçan OPC kültürleri, tipik olarak astrositler, ardından ana kirletici hücre tipi olarak mikroglia ile% 90 saf olan bu protokolü kullanılarak hazırlandı. İlköğretim Glial Hücreler HIgM12 Kullanılması 5. İmmünositokimya HIgM12, anti-PSA mAb, ve Hücre tipi WT ve NCAM KO fareler ile İlköğretim Glial hücreler spesifik Belirteçler kullanarak Triple-etiket İmmünofloresan Canlı hücre koşullar altında, etiket% 60 birleşen fare PDL-kaplı yetiştirilen WT ve NCAM KO farelerden alınan glia kültürleri karışıkHIgM12 (10 ug / ml) ve PBS içinde bir anti-PSA mAb (klon 2-2B) (10 ug / ml) ile 25 mm'lik cam lamelleri, 30 dakika boyunca 4 ° C'de% 10 FBS ile takviye edilmiştir. buz soğukluğunda PBS ile her seferinde% 10 FBS ile takviye edilmiş 20 sn için hücreler üç kez yıkayın ve 25 ° C'de 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid, pH 7.4 ile sabitleyin. PBS ile her seferinde% 10 FBS ile takviye edilmiş 1 dakika boyunca sabit hücreler iki kez yıkayın ve 25 ° C'de 2 dakika boyunca PBS pH 7.4 içinde% 0.1 Triton-X100 ile hücrelerin geçirgenliği. Soğuk odada 4 ° C'de gece boyunca% 10 FBS ile desteklenmiş 1 dakika boyunca iki kez hücreleri yıkayın ve glial belirteçler GFAP (astrositler) veya PBS IBA-1 (mikroglia) (1 mcg / ml) ile etiketlemek. Orta 31 montaj DAPI içeren dahil standart immünfloresan koşulları ile devam edin. Not: Kullanım floresan insan için ikincil antikor (HIgM12) ve fare (anti-PSA mAb, klon 2 – 2B) olarak fab 2 fragmanları etiketli IGMS şiddetle tavsiye edilir. fl al60X ya 100X büyütmede uorescent ve görüntüler. aynı tüm görüntüleri ve süreç görüntüler için aynı cihaz ayarlarını kullanın. Birincil Antikor olarak HIgM12 kullanarak ENDO-NF-tedavi WT Glia Hücre İmmünofloresan Etiketleme Neurobasal A'da 3 gün için büyütülmüştür Kültür WT fare karışık glia PDL kaplı 25 mm'lik cam lameller üzerine,% 10 FBS ve B27 eki (1:50) ile takviye edilmiştir. 1 ml kültür ortamına endo-NF (30 ug / ml) ilave edilir ve bir hücre kültürü inkübatöründe gece inkübe (37 ° C,% 5 CO2). 5.1.1 5.1.5 adımlar açıklandığı gibi etiket hücreleri HIgM12 ve fiksasyon ve permeabilization sonra iç astrositik işaretleyici GFAP soğuk yaşıyor. 60X veya 100X büyütmede floresan görüntü almak. Tüm görüntüler için aynı enstrüman ayarları kullanın ve aynı süreç.