A ligação do anticorpo especificidade para Kappa (VK) Humanos (IgM) Anticorpos contendo Cadeia Luz: Acid polissiálico (PSA) Anexado a MACN como um estudo de caso

protocolos e procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelas comissões da Clínica Mayo de cuidados de animais e uso institucional (Mayo IACUC número de protocolo # A51912). 1. Geral CNS preparação do tecido Gerar MACN deficiente camundongos (KO) em C57 / BL6 fundo (gentilmente cedido pelo Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), ratos NCAM heterozigotos e irmãos de tipo selvagem (WT) (C57 / Bl6) cruzando os heterozigotos. Genotipagem de ratinhos KO MACN foi descrito anteriormente 32-34 e não será explicado em mais pormenor. Nota: Os passos 1,2-1,6 são opcionais. Antes da cirurgia, administrar uma solução de pentobarbital (de Stock: 25 mg / ml; 50/100 ul de pentobarbital para os respectivos estágios adultos pós-natal precoce) através de injecção intraperitoneal (agulha de calibre 27 e 1 mlseringa). Espera durante 2 minutos ou até que o animal atingiu um plano cirúrgico de anestesia. Administrar anestesia adicional conforme necessário, durante o curso de cada operação de manter um plano cirúrgico de anestesia. Use toe método pinch-resposta para determinar a profundidade da anestesia. Os animais devem ser responder antes de continuar. Faça um 0.5 – 1 centímetro incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Cuidadosamente separar o fígado a partir do diafragma. Fazer uma pequena incisão no diafragma utilizando um curvos, tesoura sem corte. Continuar a incisão diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Coloque curvas, tesoura sem corte ao longo de um lado da caixa torácica, deslocando cuidadosamente os pulmões, e fazer um corte através da caixa torácica até a clavícula. Faça um corte semelhante no lado contralateral. Elevação do esterno de distância, aparar cuidadosamente qualquer tecido ligando-o ao coração. Realizar uma incisão ao animalDo átrio direito com íris tesouras para criar tão grande uma saída possível. Injecte lentamente 10 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) no ventrículo esquerdo do animal (luz vermelha; taxa de fluxo: 1 ml / min) usando uma seringa de 10 mL, equipado com uma agulha de calibre 27. Não aumente a pressão de fluxo / PBS durante a perfusão para evitar a destruição do tecido. Decapitar ratos neonatal usando uma tesoura cirúrgica. Remover o cérebro, agarrando as órbitas com uma pinça e através da inserção de uma pequena tesoura na coluna vertebral. Corte o crânio para a frente ao nível do ouvido. Retire o crânio e colocar suavemente o cérebro para uma placa de Petri 60 milímetros preenchida com 10 ml de meio de dissecção gelado sobre gelo (Tabela 1). Colocar cada cérebro em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar imediatamente em gelo seco (-79 ° C). Faça uma incisão na cerebelo e tronco cerebral a partir de cérebros congelados usando uma lâmina de barbear limpa no gelo. Trabalhar rapidamente para evitar o descongelamento do tecido. Pesa-se océrebro congelado, colocado num tubo de 15 ml em gelo e adicionar tampão de lise arrefecido em gelo (ver Tabela 1) a uma concentração final de 150 ug de tecido cerebral por ul de tampão de lise. Repita para os restantes cerebra. Manter cérebros em gelo em todos os momentos para as etapas de 1,9 – 1,11. Homogeneizar cérebros em tampão de lise por trituração através de uma pipeta de 1 ml de ponta (10 vezes) seguido por trituração através de uma seringa de 5 ml equipada com agulha de calibre 27 (10 vezes). Incubar lisados ​​cerebrais durante mais 30 minutos em gelo para permitir que a lise do tecido completo. E remover o material de lípidos cerebrais detergentes insolúveis através de centrifugação de série (quatro rondas a 19.000 xg durante 10 min a 4 ° C). Rejeitar (branco) de mielina e de detritos celulares contendo sedimento mas reter o sobrenadante depois de cada passo de centrifugação. lisados ​​cérebro alíquotas e armazenar a -80 ºC. 2. imunoprecipitações Usando IgM Humano (HIgM12 e Isotype Controle IgM) como um "pull-down" Agente de Cerebral Os lisados ​​de WT e KO MACN Proteína G agarose grânulo Preparação 9,35,36 Preparar 200 ml de tampão de IP, incluindo BSA (ver Tabela 1). Preparar mais 200 ml do mesmo tampão sem BSA IP. Por imunoprecipitação transferência de reacção 100 ul de Proteína G agarose suspensão usando uma pipeta de 200 uL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Não faça proteína vortex esferas L agarose! Adicionar 1 ml de tampão de PI (ver Quadro 1) a cada tubo. Misture Proteína G agarose e tampão IP manualmente através de inversão (cinco vezes). Lavar proteína G esferas de agarose quatro vezes por centrifugação numa centrifugadora de bancada (1000 x g, 2 min, 25 ° C). Tire sobrenadante utilizando uma pipeta de 200 uL, sem perturbar o sedimento de agarose. lavar Repita os passos 2.1.2 a 2.1.3 três vezes adicionais. Equilibrar proteína G de agarose em 1 ml de tampão IP adicionado de fresco sobre um rolo durante a noite a 4 ºC. Antígeno-anticorpo-agarose L Formação de Complexos e detecção de antígeno no Western Blot Incubar 30 mg de tecido cerebral lisadas (~ 200 ul de lisado) em 1 ml de tampão IP gelada com 20 ug de anticorpo IgM (HIgM12) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante a noite num cilindro a 4 ºC. Girar proteína G de contas de agarose (passo 2.1.4) numa centrífuga de bancada durante 2 minutos a 1000 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 200 uL, sem perturbar o sedimento de agarose. Adicionar a solução arrefecida anticorpo-cérebro lisado (a partir do passo 2.2.1) para a proteína G de agarose utilizando uma pipeta de 1 ml. Incubar a antígeno-anticorpo-proteína suspensão L agarose, durante 2 horas em um rolo a 4 ºC. Lavar o complexo anticorpo-antigénio ligado a agarose L através de centrifugação a 1000 xg durante 2 min, 4 ºC. Cuidadosamente descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicionar 1 ml de tampão de PI gelado contendo BSA a 0,2%. Repetir o passo de lavagem mais uma vez usando tampão de PI gelado contendo BSA a 0,2% e duas vezes mais usando tampão IP gelada sem BSA. Girar complexo anticorpo-antigénio ligado a agarose L a 1000 xg durante 2 min, 4 ºC. Elimine o sobrenadante completamente primeiro, utilizando uma pipeta de 200 uL até ~ 50 ul de solução são deixados em cima da proteína G da pelota de agarose seguido de uma pipeta de 10 uL. Manter as amostras em gelo. Adicionar 40 ul de tampão de eluição de IP (ver Tabela 1) por 1,5 ml de tubos de microcentrífuga, dedo tubos súbito 6 vezes e de calor durante 5 minutos a 95 ºC. Coloque as amostras em gelo durante 2 min e girar para baixo durante 30 segundos a 13.000 xg, 4 ºC. Transferir o sobrenadante utilizando uma pipeta de 10 mL (~ 35 ul total) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco, sem perturbar o sedimento. Confirmar ausência de esferas de Proteína G agarose por lavagem abaixo de uma pequena quantidade de amostra eluída a parede interna do tubo. Nota: "granular"proteína G agarose são claramente visíveis se estiver presente. Se esferas de proteína G agarose estão presentes, girar amostra por mais 30 segundos a 13.000 xg e transferir o sobrenadante para limpar o tubo. Repita o passo até que não haja contas de agarose são detectáveis. Carga de 10 – 20 ul de amostras eluídas por poço em gel de poliacrilamida-SDS num sistema de tampão Tris / glicina / SDS (ver Tabela 1). Nota: O uso de 7,5% ou 4 – 20% de geles de gradiente com um volume de carregamento de 50 uL por poço para a detecção de isoformas NCAM (dimensões em gel (W x L x espessura PSA-NCAM ou: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm). Géis correm para ~ 1 hora a 100 V (1,74 V / cm 2) na bancada. Resfriamento adicional não é necessário para este passo 37,38. Proteínas de transferência de PVDF (fluoreto de polivinilideno) de membrana (dimensão de poro 0,45 um) durante 2,5 horas na câmara fria a 100 V (1,74 V / cm 2) utilizando um tampão de transferência de frio (5-10 ° C) (ver Tabela 1). membranas bloco wom 10% (w / v) de leite em pó seco em PBS-T durante 1 h a 25 ºC num agitador orbital benchtop, lavar as membranas duas vezes durante 10 min com PBS-T e a sonda durante a noite com anticorpo primário em 5% de BSA em PBS T em um agitador orbital na câmara fria. Na manhã seguinte, as membranas de lavagem uma vez rapidamente com um excesso de PBS-T a 25 ºC (incluem tampa e do recipiente), seguido por 3 lavagens com PBS-T, durante 10 min cada, num agitador orbital (80 rpm) (todos os passos de lavagem são realizadas a 25 ºC). Adicionar anticorpo secundário (peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo anti-humano anti-IgM (por HIgM12) (diluição 1: 30000) em 5% de leite seco em pó em PBS-T durante 1 h a 25 ° C num agitador orbital (70 rpm ). membranas Lavar extensivamente uma vez rapidamente com um excesso de PBS-T a 25 ºC (incluem tampa e do recipiente), seguido por 3 lavagens com PBS-T, durante 10 min cada, num agitador orbital (80 rpm) (todos os passos de lavagem são realizadas a 25 ° C) . Misture 1 ml de chemiluminescen reforçada refrigeradosce HRP componente do substrato A (reforçada reagente luminol) com 1 ml do componente B (oxidantes reagente) (por mini-blot) a 25 ºC. Use uma pinça de plástico para transferir as membranas numa toalha de papel para remover o excesso de líquido (segurá-los nas próprias bordas). contentores secos com toalhas de papel e membranas colocar de volta na recipientes (um para cada membrana). Imediatamente adicionar 2 ml do substrato pré-misturado quimioluminescência aumentada HRP (composto A + B) (passo 2.2.16.) para cada membrana e incubar durante 2 min a 25 ° C num agitador orbital (90 rpm). Fazem membranas certeza são uniformemente umedecido pelo reagente quimiluminescência. Transferência de membranas em uma luva de plástico transparente e remover o excesso de bolhas de líquido e ar com toalhas de papel. Coloque membranas na manga de plástico em um cassete de filme e, eventualmente, fita da luva de plástico na cassete. Feche a cassete. Tome a fita, filme, temporizador e tesouras para a câmara escura. Cortar canto superior direito de cada film para fins de orientação, expor filmes (diferentes) para diferentes períodos de tempo (10 seg, 1 min, 10 min) e desenvolver filmes em um desenvolvedor de filme. 3. Endoneuraminidase-NF digestão de PSA Anexado a MACN 39 Digest lisadas tecido cerebral a partir do dia pós-natal (P) 7 ratinhos WT e KO ratinhos P7 MACN (preparado a partir do passo de 1,12) durante 2 horas em gelo utilizando endoneuraminidase-NF (endo-NF), tal como ilustrado na Tabela 2 39. Adicionar 5 uL de tampão de amostra de Laemmli 4x a cada tubo (1-6) do passo 3.1 (Tabela 2). amostras de carga em um 4 – gel de poliacrilamida-SDS gradiente de 20% e repita os passos 2.2.10 para 2.2.19. membranas de sonda com HIgM12 (1 ug / ml), comercialmente disponível de anti-PSA mAb (clone 2-2B) (1 ug / ml) e anticorpo (controlo de carga) β-actina (1 ug / ml) em 5% de BSA em PBS -T. 4. Preparação de Rat e culturas Rato do SNC <strong> Preparação de lamelas de vidro Ácido-lavagem lamelas de vidro de 25 mm em HCl 1 M a 50 – 60 ºC durante 4-16 horas num exaustor de fumos, utilizando um recipiente de vidro. Agitar lamelas, ocasionalmente, através de agitação suave. Lavar lamelas de vidro extensivamente em água destilada (3x). Certifique-se de lavar o ácido entre lamelas empilhados. Lavar lamelas em 100% de etanol e seca-los em parafilme em um capuz de cultura de células. Um dia antes da utilização, aquecer as lamelas de vidro durante 24 horas num recipiente de vidro com tampa a 100 ° C num forno. Coloque lamelas de vidro no prato de 6 poços e revestimento com 3 ml de 40 ug / ml de poli-D-lisina em água estéril durante 1 hora a 37 ºC. Lavar duas vezes com água estéril, secar completamente sob capuz de cultura de células e aplicar luz UV durante 20 min. Preparação de Cultura de Tecidos de plástico para células do SNC Brasão frascos de cultura de tecido 2 60 mm placas de cultura de células ou 75 cm com 3ml ou 10 ml, respectivamente, de 40 ug / ml de poli-D-lisina em água estéril durante 1 hora a 37 ºC. Lavar duas vezes com água, secar completamente sob capuz de cultura de células e aplicar luz UV durante 20 min. Rat misturado Glia Isolamento 40 Anestesiar ratos recém-nascidos no IACUC aprovados câmara de eutanásia roedor com fornecimento de gás CO 2 (totalmente automatizada). Use toe método pinch-resposta para determinar a ausência de resposta do animal. Decapitar neonatal ratos Sprague Dawley (P0P1) (6 – 10 crias de cada vez). Remover o cérebro, agarrando as órbitas com uma pinça e através da inserção de uma pequena tesoura na coluna vertebral. Corte o crânio para a frente ao nível do ouvido. Retire o crânio e colocar suavemente o cérebro para uma placa de Petri 60 milímetros preenchida com 10 ml de meio de dissecção gelado em gelo (ver Tabela 1). Repita para os restantes crias de ratos (6 – 10 filhotes). Manter o tecido no gelo para as etapas 4.3.2 – 4.3.7. </li> Divida o cérebro ao longo da linha mediana em dois hemisférios cerebrais e, posteriormente, cortado bulbos olfatórios, gânglios da base abaixo do córtex cerebral eo hipocampo com uma pinça Dumont. Colocar o córtex cerebral isolado numa placa de Petri limpa contendo dissecando meio em gelo. Tome um córtex. Retire as meninges com uma pinça com pontas finas sob um microscópio de dissecação. Repita com os córtices restantes. Coloque todos os córtices meninges-livres em uma placa de Petri limpa no gelo. Combine hemisférios corticais de todos os filhotes em um 60 mm placa de Petri e usar uma lâmina de barbear estéril para dado o tecido cerebral em 1 mm pedaços picados. Transferir o tecido cerebral picada usando uma pipeta de 10 ml para um frasco de vidro estéril, não revestido de 500 ml e adicionar 10 ml de meio de dissecção gelado por cérebro de rato. Agitar ligeiramente o frasco enquanto a adição de 1 ml de solução de tripsina em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) (5 mg / ml de tripsina) a 9 mL de HBSS por cérebro de rato. Adicionar 2% Do volume total de solução de DNase I (1 mg / ml) e 2% do volume total de solução de MgSO 4 (3,82% MgSO 4 em HBSS (w / v)) para a suspensão do tecido do cérebro e agite bem. Tripsinizar tecido sob agitação suave num agitador rotativo durante 30 min a 37 ºC. Certifique-se de peças de tecido são flutuação durante este passo e não sedimentar para o fundo. Aumentar a velocidade de rotação, se necessário. Adicionar soro fetal de bovino (FBS) a uma concentração final de 10% (v / v) e misturar por agitação do balão de 10 vezes durante 10 seg. Arrefecer suspensão de tecido em água com gelo durante 15 min. Redemoinho frasco suavemente cinco vezes a cada segundo min. Suavemente transferir a suspensão de tecido estéreis em tubos de 50 ml utilizando 25 ml ou 50 ml pipetas e centrifugar durante 5 minutos a 200 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o tecido do SNC digerido em 15 ml de meio de dissecção gelado suplementado com 5 ml de soro fetal bovino, 0,4 mL de solução de MgSO4 (3,82%MgSO 4 em HBSS) e 1,6 mL de ADNase I (1 mg / ml). suspensão de tecido dividido igualmente em dois tubos estéreis de 15 ml (~ 10 ml cada) e tritura-se lentamente, utilizando uma pipeta de 10 ml (10 vezes) até a suspensão torna-se turvo / leitoso. Manter as células em suspensão em gelo durante o processamento do tubo seguinte. Espera durante 3 min até restante digerido SNC tecidos sedimento no fundo do tubo. Transfira o sobrenadante para limpar tubo de 50 ml, sem perturbar a fração pellet. Opcionalmente, passar sobrenadantes turvos através de filtro de células 40 mícrons e combinar a suspensão única célula resultante em estéreis tubos de 50 ml em gelo. Girar pasta de células durante 5 minutos a 200 xg, 4 ºC. Com cuidado, remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de 10 ml até ~ 2 ml de meio de dissecação são deixadas no topo do sedimento celular. pellets de células filme dedo em tubos de 50 ml (~ 10 vezes). Adiciona-se lentamente 5 ml de meio de crescimento quente (ver Tabela 1) para a suspensão de células, enquanto suavementemão agitando o tubo. Opcionalmente, repita o passo DNase 4.3.12 para um 10 min adicionais sobre o gelo com uma solução de DNase I fresco e MgSO4 -solution em caso de aglomerados de tecido visíveis ou aglomerados de DNA. tubo de redemoinho manualmente 5 vezes a cada segundo min. Placa de 50.000 células por lamela de vidro de 25 mm de uma poça de 400 ul de meio de crescimento numa placa de 6 poços e deixar que as células aderir durante 30 min numa incubadora de cultura celular (5% de CO 2, 37 ºC). Para confluente (no prazo de 24-48 horas após o plaqueamento) placas de cultura celular de 60 mm e 75 centímetros frascos de cultura de 2 tecidos, chapa de 500.000 células (60 mm de prato) ou 2 milhões de células (75 cm 2) frascos. Adicionar cuidadosamente 2 ml (por cavidade, 25 mm em lamelas de vidro de 6 poços prato), 3 ml (pratos de 60 mm) ou 10 ml (75 cm 2 frascos) de meio de crescimento aquecido a cada poço. Incubar as células durante a noite e mudar meio completamente na manhã seguinte. Em seguida, mude médio em dias alternados (dia 3, dia 5, dia 7, etc.). Nãote: Rato culturas glia mista está pronto a ser usado para imunocitoquímica ou bioquímica 24-48 horas após o plaqueamento. Culturas do mouse Mixed gliais Idêntica à dissecação de cérebros de ratos neonatais descritos nos pontos 4.3.1 a 4.3.6, decapitar neonatais ratos P0 WT e KO MACN com C57 / BL6 fundo, remover cérebros e colocá-los em meio de dissecação gelada (ver Tabela 1). Manter o tecido em gelo em todos os momentos. Divida o cérebro ao longo da linha mediana em dois hemisférios cerebrais e, posteriormente, cortado bulbos olfatórios, gânglios da base abaixo do córtex cerebral eo hipocampo com uma pinça Dumont. Colocar o córtex cerebral isolado numa placa de Petri limpa contendo HBSS em gelo. Tome um córtex. Retire as meninges com uma pinça com pontas finas sob um microscópio de dissecação. Repita com os córtices restantes. Coloque todos os córtices meninges-livres em uma placa de Petri limpa no gelo. Transferir hemisphe corticalres com uma pipeta a partir de cada ratinho em separado, estéreis tubos de 15 ml. Adicionar 1,2 ml de meio de dissecção gelado para cada cérebro e mecanicamente perturbar o tecido cerebral, pipetando-o 2 vezes para cima e para baixo usando uma pipeta de 1 ml de ponta. Adicionar 150 ul de solução de papaína (10 mg / ml em PBS), 100 ul de solução de DNase I (1 mg / ml em HBSS) e 50 uL MgSO4 (3,82% em HBSS) para cada cérebro e misturar por um movimento súbito do dedo. Incubar a suspensão de cérebro por 30 min a 37 ºC em banho-maria e misture suspensões cerebrais a cada segundo minuto a estalar os dedos. Adicionar 1 ml de FBS por tubo, misturar e arrefecer a suspensão de tecido durante 10 minutos em gelo. Girar o tecido cerebral durante 4 minutos a 200 xg, 4 ° C e ressuspender o sedimento de tecido em 1 ml de tampão de dissecação gelada suplementada com 70 ul de ADNase solução de I (1 mg / ml em HBSS) e 30 uL MgSO4 solução (3,82% em HBSS). Tritura-se o tecido cerebral usando um FBS-revestido 1 ml ponta da pipeta(~ 5 vezes) até que o sobrenadante torna-se turva. Passar o sobrenadante através de um filtro celular de 40 micron e transferir para um tubo limpo em gelo. Sedimentar as células gliais mistas através de centrifugação durante 5 minutos a 200 xg, 4 ° C. Aspirar o sobrenadante até ~ 100 ul de meio são deixadas no topo do sedimento celular. Ressuspender o pellet celular por dedos passar rapidamente (~ 5 vezes) e adicionar 1 ml de meio de crescimento do rato quente (ver Tabela 1). Opcionalmente, dissolver agregados celulares visíveis e células submetidas a lise / ADN precipitado por pipetagem suave da suspensão de células cima e para baixo (cinco vezes). rato placa de células gliais mistos sobre lamelas de vidro revestidas de PDL ou pratos de 60 mm conforme descrito nas etapas 4.3.19 – 4.3.21. Lave as células na manhã seguinte com meio de crescimento do rato quente e, posteriormente, a cada dois dias. Rato glia mista está pronto a ser usado para imunocitoquímica 48-72 horas após o plaqueamento. Rat Microglia Isolamento Cultura rato misturadoas células da glia em 75 cm frascos de cultura de 2 tecidos em meio de crescimento (ver Tabela 1) durante 10 dias. Agite fora agregados de células microgliais de culturas mistas de glia, num agitador de rotação dentro de uma incubadora de cultura celular (5% de CO2, 37 ° C) a 140 rpm durante 1 h. Retirar o sobrenadante contendo a microglia a partir de culturas gliais mistas, passá-lo através de um filtro celular de 40 micra e manter a suspensão de células em tubos de 50 ml estéreis. Nota: As culturas microgliais são tipicamente> 95% de pureza após este passo, com poucos contaminantes OPCs e muito poucas astrócitos. Opcionalmente, substituir meio de crescimento em culturas glia mistos para futuras shake-offs microgliais. Normalmente executar várias shake-offs microgliais (uma vez por semana) a partir de culturas gliais mistos. Opcionalmente, para obter purezas superiores a 95% da placa 10 mL do sobrenadante contendo microglia (passo 4.5.2) por 100 mm de placas de Petri, e incubar numa incubadora de cultura de células durante 30 min a 37 ºC. Apenas microglIA vai anexar para placas de Petri, enquanto os astrócitos e OPCs permanecem no sobrenadante. Agitar suavemente placas de Petri no sentido horário e anti-horário (cinco vezes cada) na capa de cultura de células. Aspirar o meio de cultura celular completamente e substitua com 10 ml de meio de crescimento. Resultantes culturas microgliais são> 98% pura. microglia cultura durante 7 dias em DMEM suplementado com 1% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. Rat OPC / Isolamento oligodendrócitos Para obter culturas OPC altamente enriquecido sacudir células microgliais primeiro a partir de 10 dias de idade, culturas gliais mistas cultivadas em frascos de 75 cm 2 num agitador de rotação dentro de uma incubadora de cultura celular (5% de CO2, 37 ° C) a 140 rpm durante 1 h. Descarte microglia única contendo sobrenadante ou utilizar para experiências específicas de microgliais (veja o passo 5.5). Substitua o sobrenadante contendo microglial com meio de crescimento de 10 ml e sacudir culturas gliais mistos paraoutro 18 horas num agitador rotativo a 200 rpm (5% de CO 2, 37 ºC). Recolher o microglia- e sobrenadante contendo OPC de culturas glia mistas e passar através de um filtro de células 40-micron. Recolha a suspensão de células em tubos de 50 ml estéreis. Opcionalmente, substituir meio de crescimento em culturas glia mistos para futuras OPC shake-offs. Nota: OPCs continuam a proliferar em camadas alimentadoras astrocíticos e pode ser agitada de saída uma segunda e terceira vez (uma vez por semana), embora com rendimentos inferiores. Placa 10 ml da microglia- e OPC contendo sobrenadante em placas de Petri de 100 mm e incubar numa incubadora de cultura de células durante 30 min a 37 ºC. Microglia irá anexar as placas de Petri, enquanto OPCs e astrócitos permanecem no sobrenadante. Agitar suavemente placas de Petri no sentido horário e anti-horário (5 vezes cada) em uma capa de cultura de células. Retire apenas algumas placas de Petri em um momento da incubadora de cultura de células (microglia vai começar a retirada de Petpratos ri quando agitados vigorosamente em meio mais frio). Recolher e combinar o sobrenadante contendo OPC em tubos de 50 ml. Opcionalmente, adiciona meio de cultura para pratos de Petri para serem utilizados em experiências específicas da microglia. Opcionalmente, para aumentar ainda mais a pureza das culturas OPC repetir os passos 5.6.5 e 5.6.6 uma vez com pratos de Petri frescas para reduzir a extensão da microglia em preparações OPC. Spin down sobrenadante contendo OPC enriquecido em centrífuga durante 5 minutos a 250 xg, 4 ºC. Com cuidado, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Deixar 3 ml de sobrenadante por cima do sedimento e comece a ressuspensão OPCs por um movimento súbito do dedo (10 vezes). Triturar suavemente aglomerados celulares OPC, utilizando uma pipeta de 10 ml (5 – 10 vezes). Contagem de células e a placa 50,000 OPCs por lamela de vidro de 25 mm (PDL-revestidos) de uma poça de meio de crescimento de 400 ul numa placa de 6 poços e deixar que as células aderir durante 30 min numa incubadora de cultura celular (5% de CO 2, 376; C). Com cuidado, adicionar 2 ml de meio de proliferação quente (ver Tabela 1) a cada poço. Para PDL-revestidas placas de cultura celular de 60 mm, placa 1 – 1500000 OPCs em 3 ml de meio de proliferação. Cuidadosamente substituir FBS contendo meio de proliferação com meio de proliferação fresco 3 horas após o plaqueamento os OPCs (certifique-se OPCs ligados corretamente e não desalojar durante a mudança médio). meio de permuta de cada segundo dia. Nota: as culturas de rato OPC preparados utilizando este protocolo são tipicamente 90% puro com microglia como o tipo celular contaminante principal, seguido por astrócitos. 5. imunocitoquímica, utilizando HIgM12 em células primárias da glia Imunofluorescência-label tríplice com HIgM12, mAb anti-PSA, eo tipo celular marcadores específicos em células primárias da glia de WT e MACN KO Mice Sob condições de células vivas, a etiqueta 60% confluentes rato culturas mistas de glia de ratinhos WT e KO MACN cultivadas em PDL-revestido25 mm lamelas de vidro com HIgM12 (10 ug / ml) e mAb anti-PSA (clone 2-2B) (10 ug / ml) em PBS suplementado com FBS a 10% a 4 ºC durante 30 min. Lave as células três vezes durante 20 segundos cada com PBS arrefecido em gelo suplementado com FBS a 10% e fixar com 4% de paraformaldeído em PBS, pH 7,4 durante 15 min a 25 ºC. Lavar as células duas vezes fixas durante 1 min cada, com PBS suplementado com FBS a 10% e permeabilizar as células com 0,1% de Triton-X100 em PBS, pH 7,4 durante 2 min a 25 ºC. Lave as células duas vezes para 1 min e etiqueta com marcadores glial GFAP (astrócitos) ou IBA-1 (microglia) (1 ng / ml) em PBS suplementado com FBS 10% durante a noite a 4 ºC na câmara fria. Proceda com condições de imunofluorescência padrão, incluindo DAPI meio contendo 31 montagem. Nota: O uso de fluorescente etiquetado Fab 2 fragmentos de anticorpos secundários para o homem (HIgM12) e do rato (mAb anti-PSA, clone 2 – 2B) IgM é fortemente recomendado. tome flimagens uorescent em 60X ou 100X. Use as mesmas configurações do instrumento para todas as imagens e processar imagens de forma idêntica. Imunofluorescência de células tratadas com WT glia ENDO-NF HIgM12 utilizando como anticorpo primário Cultura WT do rato glia misturado cultivadas durante 3 dias em um Neurobasal suplementado com FBS a 10% e suplemento B27 (1:50) em PDL revestidas de lamelas de vidro de 25 mm. Adicionar ENDO-NF (30 ng / mL) ao meio de cultura de 1 ml e incubar durante a noite numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO 2). células de etiquetas vivem no frio com HIgM12 e GFAP marcador astrocitário interna após fixação e permeabilização como descrito nos passos 5.1.1 a 5.1.5. Tome imagens fluorescentes em 60X ou 100X. Use as mesmas configurações do instrumento para todas as imagens e processar de forma idêntica.