JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Published: August 01, 2016
doi:
10.3791/54135
, ,
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine,University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine,University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

Summary

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır.

Abstract

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücre biyolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. FRET kullanan Çalışmalar genellikle üç boyutlu (3D) hücresel mikro taklit değil iki boyutlu (2D) kültür, istihdam. 3D hidrojel ortamında hücrelerin geleneksel widefield Epifloresans mikroskopi kullanılarak söndürüldü emisyon FRET görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmuştur. Burada sonda aktivasyon aralığında lineer oranlarını verir rasyometrik FRET prob için bir analiz yöntemi tarif edilmektedir. intraselüler siklik adenosin monofosfat (cAMP) seviyesi ölçümü, EPAC1 aktivasyonu (ICUE1) ve hidrojel malzeme tipi, bu tarifnamede, bir foto-çapraz hidrojel (PC jel bağımlı sinyal cAMP farklılıkları tespit etme yeteneği için bir sonda kullanılarak forskolin stimülasyon altında kondrositlerde gösterilmiştir polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive hidrojel (TR-jel). 2D FRET yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Bu yöntem çok az ek çalışma gerektirir. Zaten 2D FRET görüntüleme kullanan laboratuvarlar kolayca 3D mikro-hücresel çalışmalar yapmak için bu yöntemi kabul edebilirsiniz. Bundan başka, işlenmiş 3D microtissues yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama uygulanabilir. Buna ek olarak, bu tür anizotropi ölçümü ve floresans ömrü görüntüleme (FLIM) gibi ileri mikroskopi konfokal kullanarak platformlar, darbeli ya da modüle edilmiş aydınlatma ile FRET görüntülemenin diğer formları, uyumludur.

Introduction

Hücresel sinyal karmaşık ve farmakoloji, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp gibi bir çok alana ilişkin netice hem de. Faydalı araştırma araçları hücre biyolojisi anlayışımızı ilerletmek için ve doku rejenerasyonu için optimal malzemeler geliştirmek için gereklidir. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme reseptör aktivasyonu, moleküler yapısındaki ve canlı hücrelerde supramoleküler etkileşimler (örneğin., Protein / DNA kompleksi oluşması) analizi sağlayan önemli bir araçtır. FRET floroforlar 1 ila radyatif olmayan enerji transferi türüdür. Bir verici florofor ve alıcı florofor arasındaki mesafenin altıncı gücüne ters orantılı olan bir verimliliğe sahiptir. (- 10 nm tipik olarak 1) 2 Bu nedenle, nanometre ölçeğinde iki farklı moleküller arasındaki ya da bir molekülün bölgeler arasında mekansal mesafe hakkında bilgi verebilir. donör ve alıcı fluorophores farklı m olabilirolecule türleri donör yüksek enerji emisyonu (kısa dalga boyu) sahip olduğu (hetero-FRET), ya da aynı tip (homo-FRET). FRET Görüntüleme sabit veya canlı hücreler üzerinde yapılabilir, ancak yüksek hızlı konfokal sistemleri kullanılamaz olduğunda genel olarak sabit hücreler yüksek uzaysal çözünürlükte moleküler etkileşimlerin görüntüleme için kullanılır. Canlı hücreler tepki 3 sinyalizasyon gerçek zamanlı hücre içi olarak inhibe veya fiksasyon değişmiş etkileşimleri ve süreçleri incelemek için kullanılır.

istihdam Canlı hücre çalışmaları nedeniyle sadelik ve alt arka plan (düzlem hücre dışına hiçbir emisyon) bir parçası görüntüleme kullanacağım iki boyutlu (2D) hücresel kültürleri FRET. Bununla birlikte, 2B kültürleri de fizyolojik mikro ve üç boyutlu (3D) kültür 4,5 kıyasla birçok hücresel prosesleri değiştirebilir. Örneğin, hücre dışı matris etkileşimlerine hücre ve hücre yerli hücre ölçüde EAS giden 2B kültür içinde değiştirilirily hücre morfolojisi ve polarite 6 değişiklikleri gözlemledi. Bu iskelet parçaları 7,8 ve hücre şekli ve hücre iskeleti yapısı güçlü mekansal kültür ortamında 9 düzenlenir bağlamak için membran mikro (örn., Kaveolanın ve lipid sallar) ve reseptör sinyal kuvvetli kısmen kültür ortamı tarafından düzenlenir. Mechanotransduction sadece 3D matriks tarafından etkilenmiş, ancak daha karmaşık ikincil yükleme koşulları 2D kültürleri 10 oranla 3D ortamlarda doğurduğu değildir. Son olarak, 3D matrislerin geçirgenliği difüzyon azalmış ve 2B kültürlerine kıyasla sinyal molekülleri hücrenin artan bağlama ile, genel olarak, kültür ortamı daha azdır. 3D kültürlerle bir yapıştırıcı, kimyasal ve mekanik ipuçları ile ilgili fizyolojik daha benzer bir mikro oluşturmak ve gözlemlemek mümkün değildir. Hücre etkileşimleri hücre teşvik edilebilir ve yapışkan özellikleri W kontrol edilebilir3D malzemenin 11-13 yapısı, kompozisyonu ve mimari (desenleme) i. Malzemenin mekanik özellikleri de aynı şekilde, bileşim ve yapı 14,15 ile ayarlanabilir. Hidrojeller hücreleri Kültürleme bu nedenle izin aksi de-ayırt etme olur birincil hücre veya konvansiyonel teknikler kullanılarak fenotip değişim, örneğin üzerine çalışmalar FRET., Eklem kıkırdağının hücreleri. Bu durumda, bir yöntem olup, canlı 3D kültürlerde FRET tahlilleri sağlamak için gereklidir.

Onlar optik şeffaf ve mikro kontrol etmek ve hücresel ipuçları sağlamak için uygun olabilir çünkü hidrojel iskeleleri 3D FRET tabanlı çalışmalar için idealdir. Doğal polimerlerden yapılan Hidrojeller jelatin ve fibrin 16 de dahil olmak üzere on, hücre kültürü kullanılmıştır. Hücresel mikro üzerinde daha fazla kontrole Bu polimerlerin kimyasal değişiklik ile ve sentetik polimerler 17,18 kullanımı ile elde edilebilir. hydrMekanik sertliği Ögel ve geçirgenlik polimerik bileşiminin değiştirilmesi ile kontrol edilebilir ve boyut (polimer ve çapraz bağlama yoğunluğunu) 19,20 örgü. Bundan başka, hidrojeller, büyüme faktörleri ve hücre ligandlann eklenmesi vasıtasıyla biyoaktif yapılabilir. Çünkü bu olasılıklar, biosensörleme, ilaç dağıtım ve doku mühendisliği uygulamaları için hidrojellerin geliştirme araştırma 21 çok aktif bir alandır. Hidrojellerin 3D baskı da mikro-dokuların imalatı için geliştirme çalışmaları ve 15 -organs edilir. Bu nedenle, hidrojeller hücrelerin FRET görüntüleme fizyolojik hücre davranışını tahmin etmek için bir araç olarak yararlı, aynı zamanda çalışma ve mühendislik doku büyümesini optimize etmek için, bir araç olarak değil sadece.

İkili rasyometrik FRET probları sinyal iletimine eğitim çok yararlıdır ve hidrojel kültürlerde kullanılabilir. yayınlanan floresan kısmi listesi ve sondalar FRET, Hücre Göç Consortium web sitesine bakın <sup> 22. En yaygın prob tipi bir tanıma eleman (lar) (analit hassas bölge) ile ilişkili veya bağlantılı iki farklı flüorofor içerir. Bu bölgeler fluorophores ve bu nedenle FRET büyüklük (ya daha yüksek ya da daha düşük) arasındaki mesafeyi değiştirir (bir iyon veya molekül bölgenin enzimatik bölünme bağlanması, örn.) Analitin saptanması üzerine bir yapısal değişim, ilişkiyi, ve ayrılmayı geçmesi 23. Daha az yaygın ama kullanışlı prob tipi FRET büyüklüğünü değiştirir iki fluorophores spektral örtüşme, bir analit duyarlı değişim dayanır. "Tek zincirli" rasyometrik problar tek bir molekül üzerinde bağlanmış bir flüorofor çifti kullanmaktadır. "Çift zincirli" Problar farklı moleküller üzerinde florofor çiftleri kullanan, ancak sentezleme aynı ekspresyon kaseti 24'e bağlanabilir. Tek fluorofor ifade ile çalışmalar (örn., Floresan füzyon proteinleri), çalışmalar oranlı metrik aksineFRET Probes transfeksiyon verimliliği ya da hücre canlılığında kontrol etmek için, çift transfeksiyon gerektirmez. Asgari eşik (hassas konsantrasyon) 23,25 üzerinde sentezlendiğinde oranlı metrik FRET probları transfeksiyon verimi nispeten duyarsızdır. Onlar uyarım kaynağı dalgalanmaları ve diğer hücre içi çevre faktörleri (örn., PH, iyonlar) çok uzun hem fluorophores benzer duyarlı olarak duyarsızdır. Floresan ve biyolüminesens promotör-muhabir 26,27 yapıları aksine ek olarak, tepki, transkripsiyonel gecikmeye tabi değildir.

Oranlı metrik FRET probları kolay ve sık sık geleneksel widefield Epifloresans mikroskop sistemleri kullanılmaktadır. Widefield mikroskoplar çünkü sistem maliyeti, fluorofor ağartma ve yeterli zamansal çözünürlüğe sahip sinyal değişikliklerinin yakalanması ilişkin endişelerin canlı hücre görüntüleme için çizgi tarama konfokal sistemleri tercih edilir. Buna ek olarak, tek bir hücre Analhücrelerin büyük bir nüfus üzerinde Salman kararı görünümünün birden alanlar üzerinde bir motorlu sahne ve görüntü yakalama ile mümkündür. Widefield mikroskopi hetero-FRET prob sinyallerinin yoğunluğu bazlı analizini gerektirir. Yoğunluk analizi diğer FRET yöntemler gibi karmaşık donanım gerektirmez rağmen, daha alım sonrası çalışma fluorofor davranışları ve mikroskop / görüntüleme sistemi konfigürasyonları 28 etkilerini düzeltmek için gereklidir. Bir florofor yakalanan emisyon yoğunluğu uyarım enerji fonksiyonu floroforu kuantum verimi ve kombine filtre ve kamera / detektör spektral duyarlılık ve doğrusallık 2'dir. Bu verici ve alıcı için farklı olabilir ve kantitatif analiz için kalibrasyon gerektirir. Buna ek olarak, alıcı emisyonu görüntüleme (donör ikaz ışığı ile alıcısı uyarma ve kanama-through donör emisyonunun akseptör emisyon spektrumları içine) fluorophores spektral örtüşme etkilenir 2.4 Tek zincirli çift zincirli "prob bir hücre 25,28 boyunca farklı stoichiometries var olabilir ise flüoroforların." "Probları flüoroforlar ise, kendi flüoroforlar nano ekimolar, çünkü iç normalleştirilir" tek zincir " problar içindeki parlaklık (ekstinksiyon katsayısı ve kuantum verimi fonksiyonu), doğrusal olmayan, detektörün hassasiyetindeki etkileri eşiğe ve 23 gereklidir bağlanmış kuantum verimi / detektör duyarlılığı için küçük ve sadece düzeltilmesidir vardır. Bu nedenle "tek zincirli" oranlı metrik FRET probları en kolay widefield mikroskopi 24 uygulanmaktadır.

Bu kağıt, geleneksel geniş açılı epifluorescent mikroskop kullanarak 3D hidrojel kültürlerde canlı hücrelerin FRET görüntüleme gerçekleştirmek için basit bir yöntem açıklanır. Kolayca zaten 2D FRET deneyler, hem de Inter ile ilgilenen laboratuarlar yürüten laboratuarları tarafından kabul edilebilirmicrotissues hücresel sinyal. Burada siklik adenozin monofosfat (cAMP) foto-çapraz içinde canlı kondrositlerde seviyeleri (PC-jel, polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive (TR-jel, Matrigel) hidrojellerinin arasında FRET görüntüleme göre ölçüm yöntemini göstermektedir. Bir rasyometrik FRET prob forskolin, cAMP ATP dönüşümünü katalize adenilat siklaz için bir kimyasal agonist yanıt olarak cAMP seviyelerini tespit etmek için EPAC1 (ICUE1) göre kullanılmaktadır. cAMP G-protein kenetli reseptör sinyalini aracılık başlıca ikinci haberciler biridir ve doğrudan cAMP (EPACs) tarafından aktive aşağı değişim proteinleri dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin, aktive eder. flüoroforlar cAMP FRET bir azalma ile sonuçlanan EPAC alanına bağlanması üzerine birbirinden ayrılır. 3D hidrojeller hücre hidrojel malzemelerin hazırlanması, ICUE1 probuyla birlikte hücre transfeksiyon ve gömme burada açıklanmıştır. 3D FRET Deney prosedürü ve gerekli görüntü analizihücre başına sonda etkinliği açıklanmıştır değerlendirmek. Biz de widefield mikroskopi kullanılarak 2D ve 3D FRET analizi doğasında sınırlamaları tartışmak. Bir daha fizyolojik bağlamda analiz sağlar ve daha az görüntü düzeltme ve kalibrasyon gerektirmeyen beri burada sunulan teknik mevcut 2D yöntemleri üzerinde bir gelişmedir. Büyük yardımcı hücresi ve transfeksiyon tercihleri ​​korunabilir ise birçok şeffaf malzemeler kullanılabilir gerçeğinde yatar.

Protocol

1. Malzemeler hazırlanması Lin-Gibson ve ark., 29 tarafından tarif edilen yöntemlere uygun olarak bir polietilen glikol methacrylating ile polietilen glikol dimetakrilat (PEGDM, 4000 MW) hazırlayın. Seçenek olarak ise, PEGDM satın alınabilir. İlk dimetil phenylphosphonite sonra Michaelis-Arbuzov reaksiyonu ve lityum tuzu ile 2,4,6-trimetilbenzoil klorit ile reaksiyona sokularak iki aşamalı süreç ile, foto-başlatıcı, lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) sentezleme Majima ve diğerleri. 30 uygun olarak, 2-butanon içinde lityum bromür eklenerek oluşturuldu. Not: Alternatif olarak, diğer ışık başlatanlar satın ama LAP daha iyi biyouyumluluk ve verimlilik 31 çapraz bağlama gösterir olabilir. cam hidrojel bağlanmasını sağlayacak ve böylece görüntüleme sırasında hareket etmesini önlemek için cam lamelleri işlevselleştirmek. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ile kimyasal kaputuTR-jeller 31 PC-jeller ve epoksi silanlar (3-glisidoksipropiltrimetoksisilan) üreticinin protokolüne göre, 3- (trimetoksisilil) propil metakrilat. Not: Alternatif olarak, önceden kaplanmış slaytlar satın alınabilir. Kapak kayma Adım 3.8 PDMS çanak kuyudan daha büyük olması gerektiğini unutmayın. 2. Hücre transfeksiyonu Bir doku kültürü kaputu ve steril teknikler, çözülme ile ve alt konfluent istenen hücreler plaka – 15,000 hücre / cm2 6 oyuklu olmayan tedavi kültür tabakları (50% 70), bu tarifnamede sığır kondrositler. Not: Herhangi bir ilgili hücre tipi kullanılabilir, ankraj bağımsız hücreler de dahil olmak üzere. Hücreler, 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde bir gün geri izin verin. Sonraki adımlarda önce, orta kaldırmak PBS ile durulayın ve oyuk başına 2 mi fenol ve serum içermeyen ortam ekleyin. Her bir sonraki gün de 100 fenol ve serumsuz ortam ul olarak 3 eklemekBir otoklavlanmış cam test tüpüne ul transfeksiyon reaktif. Mix, hafifçe tüp sallamak. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Işığa maruz kalma sınırı herhangi. 1 ug DNA prob ve hafifçe sallamak FRET ekleyin. Oda sıcaklığında inkübe karışımı ve ışıktan uzakta 30 dakika karıştırıldı. Not: Bu deney ICUE1 plazmid olarak (Dr Jin Zhang 33 izniyle) kullanıldı. ICUE1 içinde fluorophores siyan floresan protein (OBP, donör) ve sarı floresan protein (YFP, alıcı) vardır. DNA plazmid transfeksiyon reaktif oranı farklı hücre tiplerinin optimum transfeksiyonu için ayarlama gerekir. Hazırlanan karışım (~ 104 | il) pil, fenol ve serumsuz ortam 2 ml ihtiva eden 6 kuyu her damla damla dağıtın. pipetlemeyin yukarı ve aşağı vermeyin. Yavaşça karıştırın plaka girdap. 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Not: konfluansa transfeksiyon verimliliğini önler ve reseptörlerin endojen ekspresyonu değiştirir. 3. FabrikasyonHidrojel Döküm ve Kültür PDMS Kalıpları Bir bol su miktarının ve hava tarafından takip izopropanol ile sonra kuru ile, üzerine polidimetilsiloksan (PDMS) dökme sabunla ilk camını temizlemek, yıkamak için büyük bir cam slayt hazırlamak için. PDMS kolayca Kuruduktan sonra sıyrılır, böylece üreticinin protokol başına bir silikonlaştırma reaktif ile cam davranın. Bir havza kabının üzerine toluen ile yüzey kapalı kalan reaktifi durulayın. havaya yüzey önce tamamen kurumasını ya da bekleme süresini kısaltmak için 100 ° C'de ısıyı kullanmak izin verin. Bir hidrojel yüksekliği (örneğin, 1 mm) seçin ve PDMS 1,2 katı hacmi hesaplamak cam slayt ve hidrojel yüksekliği boyutlarını kullanarak bu kalınlıkta PDMS ile cam slayt karşılamak için gerekli. Not: PDMS çekmez. beher 1 ağırlık oranında bir 10 PDMS kitleri karıştırın. de karıştırıldığında, gaz çıkışına ev tipi vakum altında beher yerleştirin. relkabarcıklar kabı taşma ve tekrar başlarlarsa vakum ieve. Not: Diğer hidrojel kalınlık kullanılabilir, fakat yüksek bir arka plan pahasına ve santrifüj (aşama 6.2) kullanılmazsa donukluk arttırılabilir. tabanı etrafında alüminyum folyo sarın ve cam kenarları PDMS içeren. Dikkatle folyo ile çevrili bu cam üzerine gazı alınmış PDMS istenilen miktarda dökün. PDMS yüksekliğini ölçün. PDMS yüksekliği hidrojel maksimum yüksekliği olacağını unutmayın. dökme sırasında herhangi kabarcıklarının oluştuğu, tekrar degas veya spatula veya iğne ile onları pop. 2 saat boyunca 100 ° C'de bir fırında bir yüzeyin üzerine vulkanize edilmemiş PDMS koyun ya da 24 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. o kürünü sonra dikkatlice yüzeyden PDMS çıkarın. Hidrojeller için istenilen şekil (3 mm örneğin, silindirik yumruk) dışarı Punch. Not: foto-sebebiyle kalıp çapından biraz dar PC-jel silindirleri verecekPDMS moleküler oksijen ile reaksiyona söndürülmesinden. delikli PDMS sterilize edin. Kısa süreli deneyler için, 1 saat boyunca% 70 etanol içinde PDMS daldırın. mikroskop objektif düzeltme uyan bir kalınlığa sahip bir steril cam lamel ile sterilize edilmiş PDMS baz oturtulması ile kalıp monte edin. Adım 6 kullanılmak üzere kenara koyun. hidrojel ve orta içeren (hidrojel daha iyi daha geniş ve uzun olan) yukarıdaki yöntemleri kullanarak daha büyük bir PDMS çanak Üretiyor. hidrojel batırmayın ve analitin seyreltme en aza indirmek için hidrojel en az 10 kat daha fazla orta hacim karşılamak. Hidrojel Öncü Çözümler 4. hazırlanması Bir doku kültürü kaputu ve steril teknikler kullanılarak, hücrelerin hemen eklemeden önce çalışma için hidrojel prekürsör çözeltilerinde uygun olan hazırlar. aşağıdaki gibi bir polimer ön-PC-jel hazırlayın. (Fosfat tamponlu tuzlu su içinde PB PEGDM toz karışımını% 10 s, pH 7.2) (w / v). 0.005 bir nihai konsantrasyonda foto başlatıcı (örneğin, LAP) ekleyin -% 0.01 (ağ / h) ve pipetleme karıştırın. LAP ışığa duyarlı olduğundan ışıktan alüminyum folyo veya kalkanı ile çözüm örtün. Not: üretici tarafından sağlanan olarak burada TR-jel azaltılmış büyüme faktörü, hücre dışı matriks kullanılır. Hidrojel Çözümleri 5. Hücre Süspansiyon Bir doku kültürü kaputu ve steril teknikleri kullanarak, kuyulardan orta aspire. oyuklara PBS ekleyin ve sonra iyice bağlanmış hücre tek tabakaları durulama kaldırın. Hücre ayrışma çözeltisi 25 cm2 başına 2 ila 3 ml kullanılarak kültür substrattan hücreleri ayırmak. 20 dakika ya da ayrışmış kadar – o zaman 10 37 ° C'de inkübe, hafifçe sallayın. hücreleri çıkarmak için gerekirse sıkıca çanak dokunun. Not: Alternatif hücre ayrışma çözümleri i do not o sınırlı bir seçim ile kullanılabilirilgi reseptörleri bölünmesiyle Analiz edilen sinyal yolağı Mpact. Hücreler müstakil sonra, hemasitometre hücreleri, fenol ve serumsuz ortam 2 ml ilave hücrelerin süspansiyonu ve sayısı. Not: kimyasal olarak tanımlanmış serum içermeyen ortam (örneğin, insülin, transferin selenyum ile desteklenmiş) da kullanılabilir. Steril şişeleri ve pelet (örneğin, 2.0 x 10 6 hücre vial başına) içine hücre türüne göre hücrelerin istenilen sayıda alikotu. Süpernatantı hidrojel habercisi istenen hacim kazandırmak ve pipetleme hücreleri askıya. Çöktü hidrojel z-ekseni imgelerken xy düzleminde 2 x 10 5 hücre / cm2 verecek öncüsünün bir hacim kullanma (örneğin, 2 x 10 6 hücre ihtiva eden bir 1 mm kalınlığında hidrojel için şişe başına 1.0 mi / ml). kabarcıklar üretmek için özen gösterin. Hızla hücre canlılığı 34. üzerinde olumsuz etkileri sınırlamak için bir sonraki adıma geçmek </ Sup>. 6. Hidrojel Hazırlık Bir doku kültürü kaputu ve steril teknikler kullanılarak, Aşama 3'te hazırlanan döküm kalıpları için hücre içeren hidrojel öncüsünü ekleme (örneğin, 3 mm çap x 1 mm yükseklik kalıp başına 7,1 ul). Mikroskop görüntüleme sistemi kalibrasyonu için kullanmak (içsel prob verimi bilinmiyorsa) kalibrasyonu incelemek için, tarif edilen aynı yöntemlere göre, ilave bir hidrojel oluşturur. Santrifüj hazırlanan hücre içeren / öncesinde jelleşme hidrojel öncülü tek bir odak düzlemine hücreleri hapsetmesi ve düzlem sinyalinin dışarı minimize ederek görüntüleme optimize etmek için çapraz bağlama (Şekil 1). ön (4 dakika boyunca 400 g), hücre tipine ve viskoziteye santrifüj zaman ve kuvvet ayarlayın. Jel veya çözüm çapraz bağlanması PC-jel hidrojel için, eşit bir maruz kalma süresi bir UV ışık kaynağının (λ = 365 nm) ile, hücre ihtiva eden ön-ışın3.2 J / milimetre kalınlık başına cm2 photocrosslink için. Not: hesaplanmasında 1 mm minimum kalınlığa kullanın. Etkilenmeler 1-5 dk aralığında düşmelidir. Asgari pozlama süresini kullanın. aşırı ışınlanarak canlılığı azaltmak ve OBP donör çamaşır suyu bu kadar hücreleri kaçının. yüksek yoğunluklu ışınlama radikal kendini söndürme ve kötü hücre canlılığı yol açar Ancak, pozlama süreleri az 60 s tavsiye edilmez. TR jel, hidrojel, bir petri tabağına dolu kalıp koyun ve termal gelate bir inkübatör gidin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. jelleşme veya hidrojel çapraz bağlama sonra PDMS hidrojel döküm kalıp çıkarmak ve (adım 3.5 dan itibaren) hazırlanan büyük PDMS çanak ile değiştirin. Bunu uymaları steril spatula ile cama aşağı PDMS basın. Bu, bir petri çanağı gibi steril bir kaba içine lamel ile çanak PDMS yerleştirin. Fenol içermeyen serumsuz ortam ekleme ya da kimyasal olarak beni tanımlanmışdium de batırma hidrojel tutmak PDMS çanak ve kapak ile oluşturulan için (serumsuz ortam insülin, transferrin ve selenyum (aşama 5.4) ile takviye edilmiş). 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Not: bir lamel ile özel bir tabak kullanıyorsanız, o zaman içinde lamel yerleştirin ve benzer orta ekleyin. Alternatif olarak, ışınlama dalga boyları CFP donör uyarma spektrumu ile örtüştüğü olarak sondalar kurtarmak için izin FRET görüntüleme gün önce bu adımı gerçekleştirin. 7. 3D FRET Görüntüleme Adım 6.4 hazırlanan petri hidrojel, PDMS çanak çıkarın ve XY mikroskop aşamasında (Şekil 2) için ayarlanabilir bir numune tutucu sabitleyin. Mikroskop sahnede örnek tutucu yerleştirin. Gerekirse amaca yağı sürün. En az 40X ve yüksek sayısal açıklık (NA) bir hedefi kullanın (örneğin, 1.3 NA) nispeten zayıf florofor yakalamak içine emisyonları. iletilen ışık görüntüleme kullanılarak görüntüleme için seçin hücreleri ve floresan görüntüleme ile transfeksiyonu doğrulayın: görüntü elde etmek için görünüm alanları (FOVs) yapılandırın. En az 15 farklı hücreler seçin. ne çok parlak ne de çok loş hücreleri seçin (aksi sonda yol açabilecek veya düşük hassasiyet doygunluk-over) ve (aksi hasar veya ikili prob çürüme gösterir) 0.0 ile 1.0 arasında FRET oranı. Sonra maruz kalma sınırı için ışığı kapatın. Hidrojel merkezine ve nispeten düz aydınlatma alanında ilgi hücreleri ile yakın seçin FOVs (Şekil 3B bakın ve aşağıdan 9.2 Adım). FRET görüntü kanalları için kamera ayarlarını yapılandırın. "Optik yapılandırmaları" (yani., Pozlama ve görüntü kanal başına kazanç) optimize etmek için FOV merkezine yakın birkaç hücreler arasında seçim yapın. Not: isimlendirme aşağıda dependin değişirmikroskop ve kamerayı çalıştırmak için kullanılan yazılımlara g. mikroskop yazılımı, NIS-Elements, görüntü yakalama ve analiz için burada kullanılmıştır. alıcı uyarma (AEM) kapsamında donör uyarma ve Alıcı emisyonu altında donör emisyonu söndürdüler emisyon (QE): tek zincirli prob FRET analizi için, FOV başına iki görüntü kanalları seçmek. Not: ICUE1 CFP YFP probu, QE için OBP uyarma ve emisyon filtre çifti için (418-442 ex, 458-482 em) ve AEM için YFP uyarma ve emisyon çifti (490-510 ex, 520-550 em) kullanılmış. doygunluk olmadan maksimum sinyal yoğunluğu elde etmek için QE ve AEM için pozu ayarlamak (ve en az olası kazanç, bir CCD kullanıyorsanız) arka plan gürültüsünü en aza indirmek için. Sonuçları (yani, uyarma gücü, iris boyutu, pozlama ve kamera kazanç) öngerilme önlemek için deney grupları arasındaki (hem fluorophores ve deney boyunca aynı yanı sıra Şekil optik yapılandırmaları tutunure 3A). Kazanılmasından sonra daha fazla analiz seçenekleri (örneğin, düzeltilmiş duyarlı emisyon (CSE) görüntüleme (Tartışma)) sağlamak için ek resim kanallarını kazanır. Em donör (QE, mikroskop yazılımı seçin CFP-OBP), Ex verici – – Em alıcı (SE seçin CFP- ICUE1 CFP YFP prob için, uyarma (Ex) ve Ex donörün emisyon (Em) kanalları kazanmak YFP), Ex alıcı – Em alıcı (AEM) YFP YFP seçin ve Ex alıcı – Em donör (YFP OBP) konfigürasyonları (Şekil 3A bakınız). Time-lapse görüntü elde etmek için yakalama oranını yapılandırın. donanım tarafından sınırlı olmadığını yakalama oranını azaltın. Kısa vadeli deneyleri için (örneğin 30 – 60 dak), sinyalizasyon kinetik yakalamak için her FOV (5 sn örnekleme hızı) için dakikada yaklaşık 12 satın almalar belirtmektedir. signi önlemek için gerekli minimum örnekleme oranı kullanınficantly prob photobleaching. mikroskop yazılımı yakalar periyotlarını yazarak satın alma hızını ayarlayın. Uzun süreli tahlilleri için (örn., 24 saat), başlangıç ​​puls yanıt yakalamak için yüksek çekim hızı ile başlar ve daha sonra, örneğin düşük bir alım hızı, her 5 dakika 10 geçin. belirlenen FOVs prob yanıtı için bir temel kurmak için 5 dakika boyunca görüntü toplama ve yakalama görüntüleri başlatmak için mikroskop yazılımı "Şimdi çalıştır" ı seçin. İstenen agonist veya antagonist analit görüntü edinme, pipet 5 dakika boyunca (örneğin, 100 nM Forskolin) sonra, pipetleme ile karıştırın ve görüntüleme devam edin. 8. FRET Kalibrasyon Sistem Kalibrasyon: aşama 6'da tarif edilen ile aynı FOV kriterleri ve optik yapılandırmaları ve kamera seti kullanılarak en az 6 Örnek hücrelerin AEM görüntüler elde etmek için, imal ilave kalibrasyon hidrojel kullanıntings (Adımlar 7.1, 7.2, ve 7.3) Yukarıdaki FRET görüntüleme için kullanılır. Not: Kombine prob ve mikroskop görüntüleme sistemi için kuantum verimi ve spektral duyarlılık (QS) miktarının belirlenmesi "mutlak" FRET analizi değil "göreli" FRET için gereklidir. Tam yoğunluğu (AEM kanalında uyarma) uyarma ışığına 5 dk uzun pozlama seçerek alıcı fluorofor photobleach. ilgi sadece hücreleri ağartmak için dar bir diyafram kullanın. AEM sinyali öncesi ve photobleaching sonra sinyal yoğunluğu histogramı ( "LUT" pencere) karşılaştırarak orijinal sinyal en az% 10 daha düşük olduğundan emin olun. sinyal kaybı% 90'dan az olması durumunda photobleaching devam edin. Not: donör uyarma spektrumu ile örtüşmeyen AEM uyarma filtreleri kullanarak donör fluorofor bu işlem sırasında ağartılmış olmadığından emin olun. Şimdi ağartılmış alıcı fluorofor ile donör uyarma altında bize (Dem) donör emisyon EdinmeAdım 7.3 QE aynı optik yapılandırmayı ing. aşağıda Bölüm 9 gibi, arka plan düzeltme sonrası AEM bölü Dem olarak piksel başına QS hesaplayın. QS = Dem / AEM Hücresel ortalamalardan hücreler arasında ortalama QS hesaplayın. Kalibrasyon numunesi kullanılarak prob (Ei) doğasında FRET verimliliği tahmin edin. prob maksimum FRET neden ve Ei = 1 hesaplamak – Aşağıdaki bölümde 9 gibi QE / (AEM QS x). (QE / Dem) – Alternatif olarak, Ei = CSE / AEM, veya Ei Ei = 1 ile FRET verimliliği için geleneksel bir uç nokta deneyi kullanılarak hesaplanmıştır kullanın. Not: Ei aktif prob (FAP, yani analit bağlayıcı prob fraksiyonu) mutlak kısmını ölçmek için gerekli, ama FRET "göreli" analizi için gerekli değildir. analit ile etkileşim üzerine FRET artması problar için analit üretim / aktivasyon bir agonisti ile kültür uyararak prob yanıtı doyurabilecek. Sonda interactio inhibeanaliti bağlanması üzerine FRET azalma problar için sinyal bir antagonisti kullanılarak analit ile n. (Belirli) ya da 3-izobutil-metil-ksantin (spesifik olmayan) 5'-dideoksiadenozin, ICUE1 prob halinde 2 gibi bir adenil siklaz önleyicileri 'ile cAMP seviyelerini baskılamak: edin. 9. FRET Oranı Hesaplama Beraberlik ve zamanla her FOV arka plan seviyesi (Şekil 3B) tanımlamak için hücrelerin etrafında FOV başına ilgi alanları (ROI) bir bölge tayin, ancak (görüntünün ortasında üzerinde Şekil 4A nispeten homojen aydınlatma alanına ROI kısıtlamak ). Arka plan düzeltme seçenekleri hakkında açıklama için tartışma bakın. mikroskop yazılımı ile: "Arka plan ROI Icon" oka seçip (diğer şekiller çalışacak) "Eliptik Arkaplan ROI çizin" i seçin. "Ofset Arka Plan güncelleme" Keep emin olun seçilir. vie etkinleştirmekArka plan ROI ikonuna tıklayarak arka plan ROI kanat. Alternatif olarak, "YG Simge" ve "ROI her multipoint farklıdır" "Arkaplan ROI olarak kullan" ve olarak ayarlanmış ROI özelliklerini kullanın. ImageJ ile: yuvarlak çizim aracı seçmek için araç çubuğunu kullanın. Ardından "→ Araçlar → YG Müdürü Analiz" menüsü üzerinden ROI yöneticisi şekil ekleyin. istenirse ROI Yöneticisi arka plan ROI için farklı bir renk olarak ayarlayın. Her FOV ve görüntü kanalı (örneğin, QE ve AEM) için, kanal başına düzeltilmiş görüntü oluşturmak için zaman noktası başına arka plan ROI içinde ortalama değer çıkarmak, örneğin, SQE t, p = QE t, p – BQE t, p t etme zamanı, s FOV (yani, XY konumu) ve BQE ve bAem arka ROI içinde sinyalin sayısal değerleridir. Yazılımın görüntü aritmetik işlevleri kullanılabilir kullanın. Wmikroskop yazılımı i, "YG Arkaplan Simge" kullanmak ve "Çıkart Arkaplan ROI kullanma" seçeneğini seçin. Pop-up pencerede, "üzerinde Çıkar arka plan ROI" altında "Her Image" seçin ve "Uygula" altında "Tüm Kareleri" seçeneğini seçin. Not: Bir arka plan ROI düzgün çalışması için bu işlev için her FOV tanımlanmalıdır (örneğin bazı FOV tanımsız arka plan ROI'leri varsa, işlevi düzgün arka plan ROI ile FOV için arka çıkarma değildir.). ImageJ ile Michael Cammer tarafından yazılmış makro (http://microscopynotes.com/imagej/macros/) "ROI BG Çıkarma" kullanın. Aşağıdaki analiz aşamaları için "olarak kaydet" seçerek görüntü düzeltilmiş zaman serisini kaydedin. Her FOV (Şekil 4B) analiz altında her hücre için bir ikili maske kullanarak hücrenin etrafında bir ROI tanımlayın. Başlangıç ​​o da eşiğine FOV başına görüntü AEM kanal kullanınDeneyin f, hücre sınırlarını belirlemek ve İB'leri tanımladı. İB'leri kaydedin. Mikroskop yazılım ile: her çerçeve için (yani, FOV), ilk "İkili → Eşik tanımlama" menüsünü kullanabilirsiniz ve "mevcut çerçeve için geçerli" seçeneğini seçin. hücreleri seçmek için alt eşik değerini ayarlayın. Sonra gerekirse ikili maske deliklere doldurmak için "İkili → Kapat" işlevini kullanın. Sonraki "ROI Kopyala İkili" seçmek için ROI simgesini kullanın; ikili katman otomatik olarak silinir. ROI mevcut havuzuna sonraki kare için İB'leri ekleyin. Herhangi bir sahte İB'leri silin. Sonraki ROI üzerinde "sağ tıklayın ve" ve özellikleri "Standart ROI olarak kullan" ve "ROI her multipoint farklıdır" emin olun. ImageJ ile: Her FOV için öncelikle "→ Eşik ayarlayın Görüntü →" menüsünü kullanın. Sonra Göster Outlines ile "Parçacıklar Analiz → Analiz" kullanımı ve seçilen Müdürü sahipsiniz. kullanımGerekirse "İkili → Kapat" ikili maskeli "delikleri" doldurmak için. sahte İB'leri silin. Ücretsiz eklentileri bu işlemi otomatik hale getirmek için kullanılabilir. Her pikselin QE temelli FRET oranını hesaplamak, SQE / SAEM göreceli analizi için (Adım 10 bakınız) ve E QE = SQE / Adım 8.1 elde edilen QS mutlak analizi (Adım 10) için (QS SAEM x). Görüntülerin kayan nokta bölümü kullanın. oran türevlerinin bir açıklama için tartışma bölümüne bakın. mikroskop yazılımı ile: Menü "Görüntü → Görüntü İşlemleri" kullanın ve "Yüzen Nokta" seçeneğini seçin. ImageJ ile: "Süreç → Görüntü Hesaplama" fonksiyonunu veya "Calculator_Plus.java" eklentisi birini kullanın. Not: Alternatif olarak, makro "adapte edilebilir .txt" pH_ratioMacro "FRET oranlarını hesaplamak için yukarıda açıklanan arka plan düzeltme makro istihdam ve mevcuttur. Bir tablo ve grafik yazılımı içine (ROI başına, yani) hücre başına ortalama oran aktarın. mikroskop yazılımı ile: "ROI İstatistikleri" analiz kontrolü veya "Zaman Analizi" Analiz kontrolünde "Elektronik Tablo İhracat" butonuna ND ihracat düğmesini kullanınız. ImageJ ile: İlk menü "→ Set Ölçümleri Analiz" ve emin "Ortalama değer" ve "Standart sapma" seçilir yapmak seçin. Sonra ROI Manager'ı kullandığınızda ve düğme "Ölçü" i seçin. Oluşturulan sonuçları penceresini kaydedin. 10. FRET Oran Analizi hücre başına ortalama oranlar zaman içinde ortalama hücresel FRET oranını hesaplamak (Adım 9.4 ihraç). bazal bu hesaplamada (analit uygulamadan önce oranını) oranları FRET düşünün. Not: Elektronik Tablo ve grafik yazılımı temel-subtr çizmek için kullanılmaktadırOrtalama FRET oranları ve Adım 10.1.2 gibi başlangıca bir lineer regresyon kullanılarak ortalama (SEM) kendi standart hata ve altında 10.1.3 hareket (Şekil 5 ve 6). Bağıl Analizi (tepkinin büyüklüğü): ortak bir referans numunesi her eğri Normale (örneğin, işlenmemiş örnek.). Mutlak Analizi (cevabın zaman süreci): oranı FRET onun başlangıca her eğri normalize ederek ortak bir başlangıç ​​noktasına eğrileri Shift. tablo ve grafik yazılımında, veri her orijinal sütun taban dönem için tek oran verilerini içeren yeni bir sütun ile eşleştirilmiş şekilde yeni sütunlar, (hücre başına ortalama oranların sütunlar) Interleave (oranlar analit ilave önce). veri her sütunun sonra boş bir sütun eklemek için "Ekle sütun" seçeneğini seçin. Sonra eşleştirilmiş boş sütunlar halinde temel veri kopyalama. tablo ve grafik yazılımında, "Ekle → Yeni Analiz → TRANSFO seçeneğinirm taban çizgisi Kaldır "ve ardından set" her "seçeneğini" temel doğrusal olduğunu varsaymak "için" Seçili sütun ", ve" Hesaplama "altında" Fark ". ortalama hücre oranı ve tanımlayıcı istatistikleri hesaplar. tablo ve grafik yazılımında, pop-up pencerede "Satır SEM ile anlamına gelen" seçin "SD veya SEM ile Satır araçları → Ekle → Yeni Analiz → XY Analizleri" seçin ve.

Representative Results

Tüm hidrojel ön hücreler, döküm kalıpları yukarıda tarif edildiği gibi hazırlandı. Hücre yüklü habercisi çözümleri PDMS kalıplara döküm ve sonra lamel yakın hücreleri hareketsiz ve üzülmek görüntüleme analizi (Şekil 1) kolaylaştırmak için foto-/ jelleşme önce santrifüj edildi. Ekli lamelleri ile hidrojellerin mikroskopik görüntüleme (Şekil 2) için hazırlanan PDMS görüntüleme kuyuları içinde yerleştirildi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi optik konfigürasyonlar ve görüntü elde parametreler belirlenmiştir. İkili-olmayan problar için gerekli olduğu gibi CFP YFP fluorofor çiftleri için dört FRET ilgili görüntü kanallarının Yakalama, altında (bakınız "Optik Conf." Şekil 3'te) gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada sadece iki resim tek zincirli ikili ICUE1 prob, QE = "CFP CFP" ve AEM = "YFP YFP" (uyarma emisyon) için gereklidir. Çoklu FOVs (xy konumus) birçok hücre homojen aydınlatma alanı (Şekil 3B) içindeki ikamet ettiği seçilmiştir. zaman atlamalı kazanılmasından sonra, prob için sinyal veri ihraç edildi. ROI kanallı sinyallerin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için deney (Şekil 4) başlangıcından eşiklenir AEM görüntüleri kullanılarak tayin edildi. Hücreler ifade gibi hücre havuzu arasından seçildi yeterli (çok loş değil), ama çok yüksek değil (aşırı parlak) prob (Şekil 4B). Her edinilmesine piksel başına QE ve SE FRET oranları arka plan çıkarılır görüntü kanallarının floating-point bölümü kullanılarak hesaplandı. Hücre başına ortalama FRET oranı (yani, ROI başına) hesaplandı uyarım öncesinde bazal sinyaline normalize (yani, her zaman noktalarında çıkarılır bazal bir regresyon) ve standart hata olarak hata barları ile çizilen ortalama (SEM). QE ve CSE tabanlı FRET oranları de her ikisi deforskolin uyarılması (100 nM, Şekil 5) altındaki kondrositlerde artan cAMP aktivitesi korunmalıdır. QE sinyali nedeniyle hidrojellerin içinde gömülü kondrosit cAMP aktivitesi düşük bazal seviyeye düşük olduğundan QE FRET oranı CSE FRET oranından daha arka plan düzeltme daha duyarlı idi. Hem hidrojel türleri (TR-jel ve PC-jel) forskolin ilave bir artış, cAMP sinyal yanıtını gösteren zaman FRET oranında bir artış (Şekil 6), gösterdi. QE FRET oranı ile gösterildiği gibi, PC-jel hidrojeller kondrositlerin cAMP daha büyük bir değişiklik (gösterilmemiştir) ve cAMP (E QE daha yüksek bir taban seviyesini gösterir = E QE = TR-jel içinde 0.09 vs PC-jel içinde 0.19, ) temel çıkarılan resimde gösterildiği değil. Şekil 1: Photocrosslinked Hidrojel (PC-jel) Hücre Dağılımı </strong> A: Hücre yüklü hidrojel habercisi lamel yakın bir odak düzleminde hücrelerin sayısını arttırmak için santrifüj edildi. B: Bu FOV hücrelerin sayısını artırır ve düzlem hücrelerin üzerinden arka plan sinyalinin en aza indirir. (Ölçek çubuğu = 200 mikron) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: PDMS Bulaşık Hidrojel Hidrojel mikroskopik görüntülemesi ve analit uyarılması için bir lamel baz ile yüksek bir PDMS de (hidrojelin 10x hacim) içine yerleştirilmiştir. bu deneyde boyunca yerinde kalması için PC jel hidrojellerin şeffaf ve lamel bağlanmaktadır. PDMS ayrıca en ek olarak daha geniş bir biyopsi zımba kullanılarak hidrojel hacmi 10 kat daha fazla orta içeren daha büyük yapılabilmektedirhicker PDMS levha. (Ölçek çubuğu = 2 mm) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: FRET Görüntüleme için Edinme Yapılandırma A: iktisap birden çok yerde görüntü yakalamak için her 7 saniyede yapılandırıldı. QE FRET oranı hesaplamasına sadece iki görüntü kanalları altında burada kullanılan ICUE1 probu (ikili tek zincirli prob), QE = "OBP OBP" ve AEM = "YFP YFP" (uyarma emisyon) için gerekli olan "Optik Conf." mikroskop yazılım λ sekmesinde sütun. B: FOVs ( "XY" pozisyonlar) birçok hücre homojen aydınlatma alanı içinde ikamet ettiği seçilmiştir. Resmin altındaki arsa mavi boyunca aydınlatma yoğunluğu hattını oklu gösterirBu FOV merkezi aracılığıyla erişir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4: FRET Görüntüleme Analizi ROI Seçimi A: Hücrelerin serbest faiz (ROI) bir bölge her kanalda arka plan sinyali düzeltmek için seçildi. hücresiz hidrojel yerine bir resim hücre yoğunluğu veya geçiş yüksekse, ya da hücrelerin homojen bir aydınlatma alanı içinde yer olmadığında gölgelendirme maskesi kullanılmazsa geri çıkarma için de kullanılabilir. B: Hücre ROI görüntü eşikleme ve AEM kanalının ikili maskeleme kullanılarak seçildi. nedeniyle arka plan n üretilen hücre dışı oranlarının eklenmesi nedeniyle olumsuz hücre başına ortalama FRET oranının hesaplanmasını etkileyecek hücrelerden daha büyük bir ROI seçmeoise. Bu oran hafife olarak, hücre başına her kanalın ortalama kullanarak selüler FRET oranının hesaplanması önerilmemektedir. (Ölçek çubuğu = 50 um) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5: Thermoresponsive Hidrojel (TR-jel) içinde FRET Oranlarının Karşılaştırılması QE ve SE tabanlı FRET oranları Hem forskolin stimülasyon altında kondrositte artan cAMP aktivitesini algılar. Forskolin cAMP üretimini indükleyen bir adenil siklaz agonistidir. ICUE1 prob cAMP'yi bağlandığında FRET azalır ve böylece QE FRET oranı (E QE = SQE / (SAEM QS x)) artar. Tersine, SE FRET oranı azalır ve böylece E SE = 1 olarak çizilir – CSE / SAEM. hidrojel gömülü kondrositlerde, QE FRET oranı düşüklüğü nedeniyle bazal cAMP etkinliği SE FRET oranından daha arka plan düzeltme QE sinyali düşük olduğundan daha duyarlıdır. Hata çubukları = SEM, n = 25 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 6: Farklı Hidrojeller içinde FRET Oranının Karşılaştırılması Her iki hidrojel tipler kondrositler zaman içinde artış QE FRET oranı gösterdiği gibi, cAMP aktivitesi bir artış ile forskolin uyarılmaya yanıt verdi. Hidrojel tipi etkiler forskolin ve bazal hücre cAMP aktivitesi geçirgenlik farklılıkları dahil olmak üzere çeşitli etkileri vasıtasıyla hücresel yanıtı (E QE = E QE vs PC-jel içinde 0.19 = 0.09, TR-jel içinde, gösterilmemiştir). Hata çubukları = SEM, n TR-jel= 25, n PC-jel = 15. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu çalışma FRET görüntüleme 3D hidrojeller hücresel sinyalizasyon analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Önceki çalışmalar hidrojeller 38 ile hücre dışı etkileşim, hidrojel yüzeylerde 35-37 numaralı seribaşı hücrelerin FRET görüntüleme gösterdi ve hidrojeller 39-41 sıkışıp moleküllerin iken, bu içinde gömülü hücrelerin FRET görüntüleme bazlı hücre içi analiz tanımlamak için ilk yayındır 3D hidrojeller. 3D 2D FRET görüntüleme çeviri yaparken iş birkaç uygulama sorunları çözer. İlk olarak, yüksek sayısal açıklık hedefleri yeterli emisyon sinyalini toplamak için FRET görüntüleme için gerekli, ama onlar alan derinliği sınırlamak vardır. Burada hücreler biraz bunu telafi etmek için cam yakınındaki bir odak düzlemi hücre sayısını arttırmak için santrifüjleme ile yerleşmeye izin verilir. İkinci olarak, 3D hidrojel iskeleleri analizi komplike görüntüleme sırasında görüş alanı boyunca kayabilir. hidrojeller Burada CoV bağlandıklarıerslip bu deney boyunca sabit olarak kalacak şekilde. hidrojeller hücre görselleştirme engelleyebilir çünkü 3D FRET için uygun hidrojel bileşimlerinin Üçüncüsü, seçim esastır. PC-jel ve TR-jel burada şeffaf hidrojeller kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lamel civarındaki bir odak düzlemine santrifüj ile hücreler toplama hidrojel diffraction.The seçimi hidrojeller 42 üzerinde bir inceleme bulunabilir simüle edilmelidir mikro-koşullara bağlıdır daha yüksek olan hidrojeller görüntü hücreleri için kullanılabilir . Dördüncü olarak, alternatif bir hesaplama tek zincirli ICUE1 prob FRET oranı (yani, D QE = QE / cAem) analiz için gerekli resim kanal sayısını en aza indirmek için ve böylelikle photobleaching en aza indirmek için kullanılır. Hücre başına ortalama FRET oranı gerçek FRET oranının küçümsenmesi en aza indirmek için bir hücre içinde piksel başına oranlarının ortalaması olarak hesaplanır. Son olarak, bir lineer oranlı metrik analiz ve araçlartek zincirli bir ikili probları aktif fraksiyonu hesaplamak için tarif edilmektedir.

Widefield mikroskopi kullanılarak başarılı FRET deneyler yürüten birçok kritik yönleri vardır. donanım açısından, kamera yeni bilimsel CMOS kamera ve geleneksel CCD daha uygundur elektron çarparak CCD bırakarak, küçük sinyal değişiklikleri gidermek için yeterli duyarlı olmalıdır. en iyi FRET oranı mekansal dağılımını analiz etmek için, kamera en az iki kez objektif (Nyquist kriteri) noktası yayıldı fonksiyonu uzaysal çözünürlüğü sahip olması gerekir. Bu göreve çift görüntüleme sistemleri daha az uygun hale getirir. Daha önemli fluorophores photobleaching en aza indirecek şekilde verilen FRET çifti için uygun bir pozlama ve görüntü elde etme oranını seçmektir. Bir azalmış alım hızı deneme süresi arttıkça tavsiye edilir. Hızlı filtre çarklarını kullanılması edinme oranı ve analiz ederken kaçının için FOVs sayısını artırırÇift görünümü ve taret filtre küpleri ile görüntü kaydı sorunlarını ing. Homojen olmayan aydınlatma alanı örnek otofloresansı ve kamera sistemi gürültü doğar eşiğe için düzeltme zorlaştırmaktadır. Bazı hidrojeller özellikle kollajen proteinleri ihtiva eden 43,44 derece otofloresan bulunmaktadır. FRET oranları arka plan düzeltme olmadan ihmal edilir. Burada sık sık görüntü (Şekil 3B, Adım 7.2) merkezi üzerinde epi-floresan aydınlatma ile konfigüre edilebilir nispeten düz aydınlatma alanında dayanan basit bir arka plan düzeltme yöntemi kullanır. Bu yöntem, bu nedenle bu aydınlatma alanında kişilerce ilgi hücreleri kısıtlar. Burada anlatılan arka plan düzeltme ikili sonda okumak dalga boylarında hücresel otofloresans için hesaba katmaz. Böyle bir durumda, etiketlenmemiş hücreleri (prob transfeksiyon) çıkartılır, aynı koşullar ve arka plan altında görüntülü olmalıdır. A metiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücrelerden IX kullanılabilir ve etiketlenmemiş hücreleri arka plan ROI için seçildi. tüm görüntü alanı üzerinde hücre analizi sağlamak Alternatif yöntemler hücreleri olmadan bir gölgeleme maskesi kullanımı, birden fazla arka plan ROI'leri, ya da aynı örneklerini ve bir protokol istek üzerine mevcuttur.

3D FRET görüntülemeye özgü prob yanıt analit (Şekil 6) hidrojel geçirgenliği son derece duyarlıdır. Bu nedenle, aynı hidrojel bölgeleri tercihen geometrisi simetri noktasında Burada kullanılan şekilde iskele merkezi olarak, deneysel tedavi boyunca karşılaştırılır. Seçenek olarak ise, mikro-akışkan odalar / biyoreaktörler hızlı ve homojen bir analit çözelti 45 ile hidrojel perfüze edilmesi için kullanılabilir. Bir FRET sinyal hidrojelin otofloresans çok yüksek olduğunda (sinyal gürültü oranı çok düşük olduğu) tespit edilemeyebilir; Daha ince bir hidrojel veya farklı prob (farklı flüorofor) kullanılmalıdır.photocrosslinked hidrojellerin 3D FRET görüntüleme ile ilgili olarak, asgari ışınlama maruz kalma ve sonda fluorophores uyarma spektrumları dışında dalga boylarının kullanılması tavsiye edilir. LAP başka potansiyel hücresel hasara 31,46 en aza indirmek için 405 nm'de bir görülebilir ışık kaynağı ile birlikte kullanılabilir. Bu sonda beyazlatma minimize Ancak, 365 nm radyasyon ile kullanarak LAP tavsiye edilir. zirve uyarma yatıyor nm 405 ise 365 nm, CFP donör uyarma spektrumunun kuyruk sonunda yatıyor. Seçenek olarak ise, prob sentezleme bir gün kurtarmak için izin verilebilir. İkili sondaların kullanılmasıyla ifade seviyeleri ve verici ve alıcı florofor moleküler difüzyon farklılık- larına karşı duyarlılığın sorunlarını en aza indirir. İkili-olmayan problar kullanılır, ancak SE yerine eksitasyon ve emisyon spektrumları spektral akmalarını için QE görüntüleme ve ek düzeltme ile (aşağı bakınız) olabilir. Ayrıca, düşük ticari kullanılabilirlik ve FRET probları tasarımı karmaşıklığıbir engel olabilir. Başarılı deneyler için en kritik faktör floresan sinyalleri doğru düzeltme ve analiz kalır.

FRET oranı Alternatif bir hesaplama ışıkla ağartma minimize yanında birkaç ek nedenlerle kullanılır. Ikili tek zincirli probları için, sık bildirilen oran donör uyarma (söndürüldü emisyon, QE), yani altında donör emisyonuna donör uyarma (duyarlı emisyon, SE) altında alıcı emisyonu, oranı = SE / QE 25,47,48 FRET. SE / QE FRET verimliliği 21,22,47 değişikliklere doğrusal olmayan görecelidir. Yani oran probu (Ei) doğasında FRET verimliliği katlanarak doğrusal olmayan bir ilişki vardır (Donius, AE, Táboas, JM yayınlanmamış çalışma. (2015)), daha az yaklaşık% 15 oranında daha Ei oran en lineer. SE / QE da aktive sondalar (FAP, yani analit bağlayıcı prob fraksiyonu) fraksiyonu hafife. therefoyeniden, SE / QE analizi hantal bir denge doz tepkisi çalışması ve eğri fit gerektirir. Neyse ki, alıcı uyarma altında alıcı emisyon SE veya QE oranları (AEM) yani Ei ve FAP, açısından doğrusal, FRET oranları SE / AEM ve QE / AEM. SE / AEM genellikle ikili problar için kullanılan ve yalnızca (prob aktivitesi ve tam prob aktivitesi) uç nokta kalibrasyon gerektirir, ancak bazal hücresel sinyal bu zor yapar. Son nokta kalibrasyon ihtiyacını ortadan kaldırmak için, SE donör ve alıcı uyarma ve emisyon spektrumları spektral örtüşme (spektral boşaltma yoluyla) ve kombine prob fluorophores ve mikroskop kuantum verimi ve spektral duyarlılık (QS) için (CSE) düzeltilebilir görüntüleme sistemi. CSE dayalı düzeltilmiş SE FRET oranı, yani bir görüntü, E SE = CSE / AEM her pikselin içinde prob gözlenen FRET verimliliği tanımlar. Ticari ve özgür yazılım bu etkilerin SE düzeltmek için kullanılabilir veokuyucu yöntemleri 50 ayrıntılı bir açıklama için Chen ve Periasamy 2006 çalışmaları denir. Ancak, E SE hesaplanması zaman noktası (SE, QE, AEM) başına üç resim kanallarının yakalama gerektirir. Sadece iki görüntü kanallarının yakalama (QE ve AEM) gerektirir QE / cAem, – Bu nedenle, bu çalışmada biz de alternatif bir FRET oranı E QE = 1 kullanır. Bu kanallardan E QE hesaplanması sadece QS (cAem = AEM QS x) için AEM düzeltme gerektirir. QS = Dem / AEM kolayca Dem alıcı ağartılmış ile donör uyarma altında donör emisyonu bir kalibrasyon numunesi, iki görüntüleri kullanarak tahmin edilmektedir. Herhangi bir anda FAP prob Ei E SE veya E QE karşılaştırılarak hesaplanabilir.

Sonuçta, FRET oranı seçimi (E QE = QE / cAem vs E SE = CSE / AEM) prob Çeşidi değerlendirilmesi ve en iyi sinyal ile kanallarda dayanmalıdır. İkisizamanla otofloresansı değişikliklerin hesaba yukarıda tarif edildiği gibi yaklaşırsa kare başına görüntü arka plan gürültü düzeltme bulunmaktadır. Bunlar genellikle tasarım ve mikroskop filtre yapılandırmasını soruşturma nedeniyle durum Dem uyarma spektrumu içine AEM uyarma ışık hiçbir örtüşme varsayalım. Tek zincirli probları birini kullanabilirsiniz ve seçim kamera gürültü en iyi sonda sinyali (parlaklık) ve SE ve QE kanallarda arka plan sinyali dayanır. ICUE1 prob ve burada kullanılan deneysel koşullar (hücre ve hidrojel tipleri) için, SE QE daha güçlü bir sinyal var. Çift zincirli Probes dolayı verici ve alıcı florofor arasında eşit olmayan moleküler dağılımına e se kullanımını gerektirir. Gibi ICUE1 olarak analit bağlanması üzerine FRET azalma biz E SE = 1, burada olduğu gibi verim analit bağlanması üzerine olumlu bir sinyal değişikliği sunmak "ters" olabilir FRET problar için – CSE / AEM veya E QE = QE / (AEM QS x).

th analizie FAP FRET oranlarının uygun bir düzeltme ve Ei tahmin duyarlıdır. Bu QS için kullanılan aynı kalibrasyon numunesi ve geleneksel bir bitiş noktası ile FRET tahmin edilebilir Ei = 1- (QE görüntü alıcı photobleaching ve Dem görüntü ardından) 28, ama dikkat edilmelidir (/ Dem QE) en aza indirmek için verim deneyi verici kazara ağartma. QS arındırılmış AEM göre Dem tahmini, ikame edilmiş bir modifiye edilmiş versiyonu tarif yani Ei = 1 – (QE / (AEM) qS x). Alternatif olarak, Ei = CSE / AEM kullanılabilir. canlı hücrelerde Ei Tahmini tüm sondalar tam FRET tahrik olmasını gerektirir. Bu analit bağlanması üzerine FRET azalma gibi ICUE1 olarak problar için pratikte elde etmek zordur. Hücre lizatları ve saflaştırılmış analit ile Ei bir in vitro bazlı hesaplama iyi olmakla birlikte, bu işin kapsamı dışındadır. Burada hücrelerde cAMP azaltmak için 2 ', 5'-dideoksiadenozin kullanmanızı öneririz. Ancak, göreceli FAP b olabilirE sinyalizasyon taban seviyesinden türetilmiş bir Ei tahmini kullanılarak hesaplanmıştır. Bu nedenlerle, çalışmalar en sık agonist eklemeden önce sinyal temel sinyalini doyurur ikinci agonist ekledikten sonra alt sınır ve sinyal olan uç nokta kalibrasyon dayalı FRET oranını (burada yapıldığı gibi) ya da bir akraba FAP üst olduğunu rapor bağlı. Forskolin genellikle cAMP sinyali doyurulması için bir kontrol agonist olarak kullanılır. Alternatif olarak, cAMP analogu kullanılabilir örneğin 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-siklik monofosfat olarak. deneysel tedaviler arasında sinyal yolundaki potansiyel değişiklikleri belirlemek için çalışmaların bitiminde kullanılan pozitif kontroller tavsiye edilir.

hücre başına ortalama sinyal yanıtı hesaplanması çeşitli faktörlere göz önüne alınmasını gerektirir. İlk olarak, ortalama FRET oranı, bir hücre içinde, her pikselin oranlarının ortalaması olarak hesaplanmalıdır, yani, (Σ (QE/cAem)) / (piksel sayısı) yerine RABir hücrenin ortalama QE ve AEM, yani, (ΣQE) / (ΣcAem) arasında bölüm. arka plan gürültü düşük olduğu için ikinci dikkatli maskeleme gerektirmez rağmen, ciddi, gerçek ortalama FRET oranını göz ardı ediyor. Ancak, piksel oranları kayan nokta hesaplama ve İB'leri tanımlamak ve hücre dışına arka plan gürültü üretilen sahte oranları dahil önlemek için hücre alanının dikkatli ikili maskeleme gerektirir. Tüm hücre alanı hücre şekline öngerilme sonuçları önlemek için ölçülebilir olmalıdır. maskeleme hücre şekli ve göç değişikliklere bağlı olarak zamanla yeniden gerekebilir. dışlama kriterleri QE ve hücresel seviyelerinin altına düşmesi ve yakın plan düzeyleri AEM sinyallerden piksel oranlarını kaldırmak için tanımlanan Alternatif olarak, hücrenin daha ROI büyük kullanılabilir. açıklanan analiz yöntemleri ayrıntılı özel yazılım / eklentileri olmadan FRET analizi için bu çalışmada kullanılan temel adımlar. Mikroskop üreticileri ve diğer satıcılar add-on modülü satmakOtomatik oranlı metrik destekleyen ve analiz FRET onların mikroskop yazılımı için s. Aynı şekilde, kamu malı ImageJ yazılım gibi RiFRET olarak parçacık ve FRET analizi için kullanılabilecek birkaç eklentileri vardır. Bir 2D görüntü kullanıldığı için İkincisi, piksel tabanlı ortalama FRET oranı 3D hücresel yapının gerçek ortalama oranını göz ardı ediyor. 2D sinyalleri temsil eden ve Z ekseni boyunca ortalama. Canlı hücrelerde FRET oranlarının 3D mekansal dağılımı hesaplanması yüksek hızlı 3D görüntüleme olmadan mümkün değildir (örn., Kullanarak disk konfokal mikroskopi iplik). Bu 2D ve 3D kültürleri hem de bir sorun, ancak uçağın dışında var olan hücresel yapının daha fazlası gibi 3D büyük bir etkiye sahiptir. Bu tür plazma zarı EPAC1 prob PM-ICUE gibi hücresel yapılar, lokalize problar için büyük bir endişe kaynağıdır. Spiering et al. 2013 önerileri oranı hesaplamaları 24 hücre kalınlığı etkileri düzeltmek için. AEM dağılımının analizi için kullanılabilirSonda ayarlanmış hücre ve görüntüleme uçağın bölgelerinde birikir algılamak. Bu aynı zamanda, FRET oranlarının dağılımını yorumlamak ve sahte sonuçlarını ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır, örneğin., (Düşük AEM bölge düşük prob konsantrasyonuna sahip olacak ve prob doygunluk ve yüksek FRET oranını gösterebilir yani) prob doygunluğu belirlenmesi. Üçüncü olarak, farklı bir FRET bazal seviyeleri, Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık gösterir Deney grupları arasında ifade veya bazal sinyal prob olabilir. "Bağıl Analizi" (Adım 10.1.1) varsa zamanla FRET oranında sürüklenme temizlenmesine yardımcı olur. Bu örnekler arasındaki tepkilerin nispi büyüklük karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ancak referans numunesi için tepki (kontrol arsa düz bir çizgidir) zaman-ders karşılaştırma engellemektedir. "Mutlak Analizi" (Adım 10.1.2) örneklerin arasında yanıtın oranı karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ama her satırı bir dissim tarafından ölçekli çünkü yanıtın büyüklüğü karşılaştırılmasını engellemektedirIlar sabiti. Çalışmalar genellikle zaman içinde FRET oranında sürüklenme düzeltmek için başlangıçtaki bir lineer regresyon kullanın.

tarif 3D FRET yöntemi imal ve diğer prob ve görüntüleme yöntemleri uygulanabilir hücre yüklü 3D hidrojeller, zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için yararlı ve pratik yoludur. yukarıda tartışıldığı gibi tek zincirli ikili sondalar yanında diğer FRET sistemi, yoğunluk tabanlı sinyallerin daha karmaşık düzeltme yapılması gerekir. Alternatif olarak, FRET (FLIM-FRET) floresans süresi görüntüleme sensörü verici emisyon ömrü bir değişiklik ile FRET verimliliği hesaplamak için kullanılabilir. Yoğunluk tabanlı FRET aksine, Flim-FRET arka plan gürültüsü, spektral kanaması-through, kuantum verimliliği ve dedektör spektral duyarlılık 2 duyarsız. Ancak, Flim sistemler, pahalı, karmaşık ve nadir olan ve tek üs çürüme ile fluorophores ve hiçbir Flim 49 run-off ile iyi çalışır. tarif edilen yöntem aynı zamanda mo ile kullanılabilecektirgelişmiş mikroskop platformları yeniden (örn., FRET TIRF, floresan anizotropi ve spektral korelasyon FRET). yüksek hızlı konfokal ve multiphoton mikroskobu ile 3D görüntüleme için bu yöntemi uygulamak sinyal yanıt alt hücresel dağılımı analizi kolaylaştırmak ve analiz sinyal doğruluğunu artıracaktır. Bu 3D FRET yöntemi simüle 3D hücresel mikroçevrelerde gelişmiş hücre biyolojisi çalışmaları sağlayacaktır. Bu nedenle, hali hazırda, farmakoloji ve hücreler arası sinyal okuyan ve lamine hidrojel bazlı microtissues ilaç tepkisi tarama içeren rejeneratif tıp ihtiyaçlarına uygulanabilir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Pittsburgh, Sağlık ödülü K01 AR062598 National Institutes ve hibe P30 DE030740 Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi mali destek kabul. Yazarlar ayrıca ImageJ makro ImageJ ve Michael Cammer geliştirmek için ICUE1 plazmid Dr. Jin Zhang, Wayne Rasband teşekkür ederim.

Materials

Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. . Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O., Capri, A. . Progress in Molecular and Environmental Bioengineering – From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. , 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K., Nagamune, I. E. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. 119, 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators – Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X., Burdick, J. A., Mauck, R. L. . Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. , 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Tags

FRET Imaging3D HydrogelsIntracellular SignalingBiologie du développementPharmacologyRegenerative MedicineBiomaterialsDrug ScreeningWide Field MicroscopyHydrogel CastingCell SuspensionCrosslinkingUV ExposurePDMS DishPhenol-free MediumMicroscope ImagingFRET Ratio

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image