الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد
Summary
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) التصوير هو أداة قوية في الوقت الحقيقي للدراسات بيولوجيا الخلية. هنا يتم تقديم وسيلة للخلايا التصوير الحنق في الفسيولوجية microenvironments ثلاثي الأبعاد (3D) هيدروجيل باستخدام المجهر epifluorescence التقليدية. يوصف تحليلا للتحقيقات الحنق ratiometric التي تعطي نسب الخطية على نطاق التنشيط.
Abstract
تصوير فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو أداة قوية لفحص بيولوجيا الخلية في الوقت الحقيقي. الدراسات باستخدام الحنق عادة توظف ثنائي الأبعاد (2D) والثقافة، والتي لا تحاكي ثلاثية الأبعاد (3D) المكروية الخلوية. تم توضيح طريقة لأداء الانبعاثات مروي الحنق التصوير باستخدام التقليدية المجهر widefield epifluorescence من الخلايا داخل بيئة هيدروجيل 3D. هنا يتم وصف طريقة تحليل للتحقيقات الحنق ratiometric التي تعطي نسب الخطية على نطاق تفعيل التحقيق. ويظهر قياس (المخيم) مستويات الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي في غضروفية تحت التحفيز forskolin باستخدام مسبار لEPAC1 تفعيل (ICUE1) والقدرة على اكتشاف الفروق في مخيم يشير هذا يعتمد على نوع المواد هيدروجيل، هنا هيدروجيل photocrosslinking (PC-جل، البولي ايثيلين جلايكول dimethacrylate) وهيدروجيل thermoresponsive (TR-جل). بالمقارنة مع الطرق 2D الحنق،يتطلب هذا الأسلوب العمل الإضافي القليل. يمكن أن المختبرات التي تستخدم بالفعل الحنق التصوير في 2D تعتمد هذه الطريقة بسهولة لإجراء الدراسات الخلوية في المكروية 3D. ويمكن كذلك تطبيقها على الإنتاجية العالية فحص المخدرات في microtissues 3D هندسيا. بالإضافة إلى ذلك، وهو متوافق مع أشكال أخرى من التصوير الحنق، مثل قياس تباين والتصوير مضان عمر (FLIM)، ومع منصات متقدمة المجهري باستخدام مبائر، نابض، أو إضاءة التضمين.
Introduction
الإشارات الخلوية على حد سواء معقدة والتبعية للعديد من المجالات، بما في ذلك علم الصيدلة، هندسة الأنسجة والطب التجديدي. هناك حاجة إلى أدوات الفحص مفيدة لزيادة فهمنا للبيولوجيا الخلية وتطوير المواد المثلى لتجديد الأنسجة. فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) التصوير هو أداة أساسية تمكن من تحليل تنشيط مستقبلات، التشكل الجزيئي، والتفاعلات supramolecular (على سبيل المثال، بروتين / الحمض النووي complexation) في الخلايا الحية. الحنق هو نوع من نقل الطاقة غير الإشعاعي بين fluorophores 1. ولديه الكفاءة التي تتناسب عكسيا مع قوة السادسة من المسافة بين fluorophore المانحة وfluorophore المتقبلة. وهكذا، يمكن أن توفر معلومات عن المسافة المكانية بين اثنين من جزيئات مختلفة أو عبر مناطق جزيء واحد على مقياس النانومتر (عادة 1-10 نانومتر) 2. قد يكون fluorophores المانحة ومتقبل م مختلفةأنواع olecule (مغاير الحنق)، الذي المانحة لديه انبعاث طاقة أعلى (أقصر طول موجي)، أو من نفس النوع (هومو-الحنق). الحنق التصوير لا يمكن أن يؤديها على خلايا ثابتة أو الحية، ولكن بصفة عامة تستخدم خلايا ثابتة للتصوير التفاعلات الجزيئية في قرار مكانية عالية عندما نظم مبائر سرعة عالية غير متوفرة. تستخدم الخلايا الحية لدراسة التفاعلات والعمليات التي تحول دون أو تعديلها من قبل التثبيت، مثل داخل الخلايا في الوقت الحقيقي مما يشير إلى استجابة 3.
دراسات الخلية الحية التي تستخدم الحنق استخدام التصوير ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات الخلوية وذلك جزئيا بسبب البساطة وانخفاض الخلفية (أي انبعاث من خارج الخلايا الطائرة). ومع ذلك، ثقافات 2D أيضا تغيير العديد من العمليات الخلوية مقارنة المكروية الفسيولوجية وثلاثية الأبعاد (3D) ثقافة 4،5. على سبيل المثال، يتم تغيير الخلية الأم إلى الخلية والخلية إلى التفاعلات المصفوفة خارج الخلية بشكل كبير في ثقافة 2D المؤدية إلى قمة شرق آسيالاحظ إيلي التغييرات في شكل الخلية والاستقطاب 6. microdomains غشاء (على سبيل المثال، caveolae والدهون الطوافات) والإشارات المستقبلة وينظم بقوة عن البيئة والثقافة، ويرجع ذلك جزئيا إلى ربط مكونات هيكل الخلية 7،8 وشكل الخلية وهيكل الخلية هيكل وينظم بقوة بيئة الثقافة المكانية 9. لا يتأثر Mechanotransduction إلا من خلال مصفوفة 3D، ولكن بسبب الظروف تحميل الثانوية أكثر تعقيدا تولدت في بيئات 3D مقارنة الثقافات 2D 10. وأخيرا، نفاذية المصفوفات 3D أقل من مستنبت، بشكل عام مع انخفاض انتشار وزيادة ملزمة من الخلايا الجزيئات مما يشير مقارنة الثقافات 2D. مع الثقافات 3D واحد قادر على خلق ومراقبة المكروية أكثر مماثلة لفيزيولوجي فيما يتعلق اللاصقة والكيميائية، والعظة الميكانيكية. خلية إلى خلية التفاعلات يمكن تعزيز وخصائص لاصقة يمكن التحكم ثإيث هيكل، وتكوينها، والهندسة المعمارية (الزخرفة) من المادة 3D 11-13. يمكن أيضا الخواص الميكانيكية للمواد تكون مصممة من قبل تكوين وبنية 14،15. زراعة الخلايا في الهلاميات المائية بالتالي تصاريح الحنق دراسات على الخلايا الأولية التي من شأنها التقليل من يفرق خلاف ذلك أو تغيير في النمط الظاهري باستخدام التقنيات التقليدية، على سبيل المثال، الخلايا من الغضروف المفصلي. وبالتالي، هناك حاجة إلى وسيلة لتمكين المقايسات الحنق في الثقافات 3D حية.
السقالات هيدروجيل مثالية للدراسات تستند 3D الحنق لأنها يمكن أن تكون شفافة بصريا ومصممة للسيطرة على المكروية وتقديم العظة الخلوية. وقد استخدمت الهلاميات المائية المصنوعة من البوليمرات الطبيعية في زراعة الخلايا على مدى عقود، بما في ذلك الجيلاتين والفيبرين 16. ويمكن تحقيق قدر أكبر من السيطرة المكروية الخلوية مع التعديل الكيميائي لهذه البوليمرات ومع استخدام البوليمرات الاصطناعية 17،18. HYDRogel صلابة الميكانيكية ويمكن التحكم نفاذية عن طريق تغيير تركيبتها البوليمر وشبكة حجم (البوليمر وكثافة تشعبي) 19،20. وعلاوة على ذلك، الهلاميات المائية ويمكن إجراء النشطة بيولوجيا من خلال إدراج عوامل النمو وبروابط الخلوية. بسبب هذه الاحتمالات، وتطوير الهلاميات المائية لbiosensing، تسليم المخدرات، وتطبيقات هندسة الأنسجة هي منطقة نشطة جدا من الأبحاث 21. 3D الطباعة من الهلاميات المائية يخضع لعملية تطوير لتصنيع الأنسجة الدقيقة و-organs 15. وهكذا، الحنق التصوير من الخلايا في الهلاميات المائية هو مفيد ليس فقط كوسيلة لتقريب سلوك الخلوية الفسيولوجية، ولكن أيضا كأداة لدراسة وتحسين نمو الأنسجة هندسيا.
ثنائية تحقيقات الحنق ratiometric مفيدة جدا في دراسة الإشارات الخلوية، ويمكن الاستفادة منها في الثقافات هيدروجيل. للحصول على قائمة جزئية من الفلورسنت المنشورة والحنق تحقيقات، راجع خلية اتحاد هجرة الموقع <sup> 22. نوع التحقيق الأكثر شيوعا يحتوي على اثنين fluorophores المختلفة التي ترتبط أو ترتبط بها عنصر الاعتراف (ق) (تحليلها المنطقة الحساسة). هذه المناطق تخضع لتغيير متعلق بتكوين أو جمعية أو تبرؤ عند الكشف عن الحليلة (على سبيل المثال، ربط أيون أو جزيء، انشقاق الأنزيمي في المنطقة) أن يغير المسافة بين fluorophores، وبالتالي فإن حجم الحنق (إما أعلى أو أقل) 23. وهناك نوع مسبار أقل شيوعا ولكنها مفيدة يعتمد على التغيير حساسة تحليلها في التداخل الطيفي للfluorophores اثنين، الذي يغير الحنق الحجم. "وحيد سلسلة" تحقيقات ratiometric الاستفادة من زوج fluorophore مرتبط على جزيء واحد. "مزدوجة سلسلة" تحقيقات الاستفادة أزواج fluorophore على جزيئات منفصلة، ولكن التعبير عنها يمكن أن يقترن تحت نفس التعبير كاسيت 24. على عكس الدراسات مع التعبير fluorophore واحد (على سبيل المثال. والبروتينات الانصهار فلوري)، ودراسات مع ratiometricتحقيقات الحنق لا تتطلب ترنسفكأيشن المزدوج للسيطرة على كفاءة ترنسفكأيشن أو بقاء الخلية. تحقيقات Ratiometric الحنق لا تعير اهتماما نسبيا لكفاءة ترنسفكأيشن عندما أعرب فوق الحد الأدنى عتبة (تركيز حساسة) 23،25. فهي حساسة لتقلبات مصدر الإثارة وغيرها من العوامل البيئة داخل الخلايا (على سبيل المثال.، ودرجة الحموضة، أيونات) ما دام كل fluorophores تستجيب على نحو مماثل. وبالإضافة إلى ذلك، ردهم لا تخضع لتأخير النسخي، على عكس فلوري وإضاءة الحيوية المروج مراسل يبني 26،27.
وبسهولة وغالبا ما يلجأ تحقيقات Ratiometric الحنق في أنظمة المجهر widefield epifluorescence التقليدية. ويفضل المجاهر Widefield على الأنظمة مبائر خط المسح الضوئي لتصوير الخلايا الحية بسبب المخاوف بشأن تكلفة النظام، وتبيض fluorophore، والتقاط التغيرات إشارة لقرار زمني يكفي. وبالإضافة إلى ذلك، الشرج خلية واحدةيسيس على عدد كبير من الخلايا هو ممكن مع القبض على مرحلة وصورة الآلية على حقول نظر متعددة. يتطلب Widefield المجهري تحليل كثافة أساس الإشارات التحقيق مغاير الحنق. على الرغم من تحليل كثافة لا تتطلب أجهزة معقدة مثل أساليب الزخرفة أخرى، هناك حاجة إلى مزيد من العمل بعد الحيازة لتصحيح آثار السلوكيات fluorophore والمجهر / التصوير تكوينات النظام 28. كثافة الانبعاثات القبض على fluorophore هي وظيفة من طاقة الإثارة، fluorophore العائد الكم، وتصفية جنبا إلى جنب والكاميرا / كشف الحساسية الطيفية والخطي 2. قد تكون هذه تختلف عن الجهة المانحة ومتقبل وسوف يتطلب معايرة للتحليل الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، يتأثر التصوير من الانبعاثات متقبل من خلال التداخل الطيفي للfluorophores (الإثارة من متقبل من قبل الجهات المانحة ضوء الإثارة وتنزف من خلال انبعاث المانحة إلى أطياف الانبعاث متقبل) 2.4؛ واحدة سلسلة "تحقيقات تم تطبيع داخليا بسبب fluorophores هم متساوي المولية على مقياس النانو، في حين أن fluorophores من" مزدوجة سلسلة "تحقيقات قد تكون موجودة في النسبة المولارية المختلفة في جميع أنحاء خلية 25،28 إذا كان fluorophores من" سلسلة واحدة " تحقيقات ذات سطوع مماثل (وظيفة من معامل الانقراض والعائد الكم)، وآثار للكشف عن حساسية غير الخطية هي تصحيح صغير والوحيد لمضان الخلفية ونوعية حساسية العائد / كاشف جانب هناك حاجة إلى 23 وهكذا "سلسلة واحدة" تنفذ تحقيقات ratiometric الحنق أكثر سهولة في widefield المجهري 24.
وتصف هذه الورقة تقنية واضحة لأداء الحنق التصوير من الخلايا الحية في الثقافات هيدروجيل 3D باستخدام المجهر widefield epifluorescent التقليدية. ويمكن بسهولة اعتمدت من قبل مختبرات تحمل بالفعل تجارب الحنق في 2D، وكذلك المختبرات المهتمة في ما بينالإشارات الخلوية في microtissues. نحن هنا لشرح الطريقة مع قياس الحنق التصوير أساس من الأدينوزين الحلقي الأدينوساين (المخيم) مستويات في غضروفية الحية داخل photocrosslinking (PC-جل، البولي ايثيلين جلايكول dimethacrylate) وthermoresponsive (TR-جل، Matrigel) الهلاميات المائية. ويستخدم مجس الحنق ratiometric على أساس EPAC1 (ICUE1) للكشف عن مستويات المخيم ردا على forskolin، ناهض الكيميائية لمحلقة أدينيليل الذي يحفز تحويل ATP إلى المخيم. المخيم هو واحد من رسل الثانية الرئيسية التوسط G البروتين يقترن مستقبلات الإشارات وأنه ينشط عوامل مختلفة، بما في ذلك البروتينات صرف المصب تفعيلها مباشرة من المخيم (EPACs). وfluorophores تتحرك بعيدا على مخيم ملزمة إلى المجال EPAC مما أدى إلى انخفاض في الحنق. وصفت هنا هو إعداد المواد هيدروجيل، ترنسفكأيشن الخلية مع لجنة التحقيق ICUE1، وتضمين الخلايا في الهلاميات المائية 3D. إجراء تجربة 3D الحنق وتحليل الصور ضروريوأوضح النشاط التحقيق في خلية لتقييم. نحن أيضا مناقشة القيود المتأصلة في تحليل الحنق في 2D و 3D باستخدام widefield المجهر. تقنية المعروضة هنا هي تحسنا عن طرق القائم 2D لأنه تمكن من تحليل في سياق أكثر الفسيولوجية ويتطلب أقل تصحيح الصورة والمعايرة. فائدة كبيرة تكمن في حقيقة أن العديد من مواد شفافة يمكن استخدامها في حين يمكن الحفاظ على الخلية وترنسفكأيشن التفضيلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذا العمل كيف الحنق التصوير يمكن استخدامها لتحليل الإشارات الخلوية في الهلاميات المائية 3D. في حين أن دراسات سابقة أظهرت الحنق التصوير الخلايا المزروعة على ركائز هيدروجيل 35-37، تفاعلات خارج الخلية مع الهلاميات 38، وجزيئات المحاصرين في الهلاميات المائية 39-41، وهذا هو أول نشر لوصف الحنق التصوير تحليل الخلايا استنادا الخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل الهلاميات المائية 3D. العمل يحل عدة قضايا التنفيذ عند ترجمة الحنق التصوير من 2D إلى 3D. أولا، هناك حاجة إلى أهداف الفتحة العددية العالية للتصوير الحنق لجمع إشارة كافية في الانبعاثات، ولكنها تحد من عمق الميدان. يسمح للخلايا هنا ليستقر قليلا عن طريق الطرد المركزي لزيادة عدد الخلايا في طائرة الوصل بالقرب من الزجاج للتعويض عن ذلك. ثانيا، قد السقالات هيدروجيل 3D الانجراف عبر مجال الرؤية أثناء التصوير مما يعقد التحليل. الهلاميات المائية مستعبدين هنا إلى COVerslip بحيث تظل ثابتة في كافة مراحل التجربة. الثالثة، واختيار التراكيب هيدروجيل المناسبة ل3D الحنق أمر ضروري لالهلاميات المائية قد تعيق التصور من الخلايا. وتستخدم الهلاميات المائية الشفافة هنا من PC-جل وTR-جل. ومع ذلك، وجمع الخلايا مع الطرد المركزي إلى المستوى البؤري بالقرب من ساترة يمكن استخدامها لخلايا الصورة في الهلاميات المائية مع أعلى diffraction.The اختيار هيدروجيل يعتمد على الظروف المكروية التي يجب أن يكون محاكاة، والتي يمكن العثور عليها في الاستعراض على الهلاميات المائية 42 . رابعا، يعمل على حساب بديل هنا للحصول على نسبة الحنق من ICUE1 التحقيق سلسلة واحدة (أي، E QE = QE / الأرصاد الجوية للطيران) للحد من عدد من القنوات الصورة المطلوبة للتحليل، وبالتالي تقليل photobleaching من. يتم حساب متوسط نسبة الحنق لكل خلية على أنه متوسط النسب لكل بكسل داخل الخلية للحد من التقليل من نسبة الحنق الفعلية. وأخيرا، تحليل وسائل ratiometric الخطيلحساب جزء تفعيلها من سلسلة واحدة تحقيقات الثنائية يوصف.
هناك العديد من الجوانب الهامة في إجراء التجارب الحنق ناجحة باستخدام المجهر widefield. وفيما يتعلق الأجهزة، يجب أن تكون كاميرا حساسة بما يكفي لحل التغييرات إشارة صغيرة، وترك أحدث الكاميرات المكمل العلمية والإلكترون ضرب أجهزة المتقارنة بواسطة الشحنات مناسبة أفضل من أجهزة المتقارنة بواسطة الشحنات التقليدية. لتحليل أفضل التوزيع المكاني للنسبة الحنق، يجب على الكاميرا على الأقل تمتلك ضعف القرار المكانية وظيفة انتشار نقطة من الهدف (معيار نيكويست). وهذا يجعل النظم المزدوج عرض أقل ملائمة لهذه المهمة. أكثر أهمية هو تحديد التعرض وصورة معدل اقتناء المناسب للزوج الحنق معين وذلك لتقليل photobleaching من لfluorophores. ينصح معدل الاستحواذ انخفض مع زيادة مدة التجربة. استخدام عجلات مرشح السريعة يزيد من معدل اقتناء وعدد من FOVs للتحليل في حين تجنبجي القضايا تسجيل صورة مع ثنائي الرأي ومكعبات مرشح برج. مجال الإضاءة متجانسة يعقد تصحيح مضان الخلفية التي تنشأ من عينة تألق ذاتي والضوضاء نظام الكاميرا. بعض الهلاميات المائية، وخاصة تلك التي تحتوي على البروتينات الكولاجينية وautofluorescent غاية 43،44. والتقليل من نسب الحنق دون تصحيح الخلفية. نحن هنا توظيف خلفية بسيطة طريقة التصحيح التي تعتمد على مجال الإضاءة مسطحة نسبيا والتي كثيرا ما يمكن تكوينها مع الإضاءة برنامج التحصين الموسع ومضان على وسط الصورة (الشكل 3B، الخطوة 7.2). ولهذه الطريقة يقيد خلايا الفائدة لتلك في هذا المجال الإضاءة. تصحيح المعلومات الأساسية المبينة هنا لا يأخذ في الحسبان تألق ذاتي الخلوية في موجات قراءة للتحقيق الثنائية. في مثل هذه الحالة، والخلايا غير المسماة (أي تحقيق ترنسفكأيشن) ينبغي تصوير تحت نفس الظروف والخلفية تطرح. ومالتاسع من الخلايا المسمى وغير المسماة يمكن استخدام والخلايا غير المسماة اختيارها لROI الخلفية. الطرق البديلة التي تنص على تحليل الخلية على حقل صورة كامل على استخدام قناع التظليل، متعددة رويس الخلفية، أو عينات مماثلة من دون الخلايا وبروتوكول متاحة عند الطلب.
محددة لتصوير 3D الحنق، استجابة التحقيق حساسة جدا للنفاذية هيدروجيل إلى الحليلة (الشكل 6). لذلك تتم مقارنة المناطق هيدروجيل نفسها عبر العلاجات التجريبية، ويفضل عند نقطة التناظر الهندسي مثل بالقرب من مركز سقالة المستخدمة هنا. بدلا من ذلك، غرف الموائع الدقيقة / يجوز استخدام المفاعلات الحيوية إلى بسرعة وبشكل موحد يروي هيدروجيل مع حل الحليلة 45. قد لا يتم الكشف عن إشارة الحنق (إشارة إلى نسبة الضوضاء منخفض جدا) عندما تألق ذاتي هيدروجيل مرتفع جدا. وينبغي أن تستخدم هيدروجيل أرق أو التحقيق المختلفة (fluorophores مختلفة).وفيما يتعلق التصوير 3D الحنق في الهلاميات المائية photocrosslinked، فمن المستحسن استخدام الحد الأدنى من التعرض للإشعاع وموجات خارج أطياف الإثارة من fluorophores التحقيق. ويمكن استخدام LAP مع مصدر الضوء المرئي في 405 نانومتر إلى مزيد من تقليل تلف الخلايا المحتمل 31،46. ومع ذلك، ينصح باستخدام LAP مع 365 نانومتر التشعيع لأن هذا يقلل تبيض التحقيق. 365 نانومتر يكمن في نهاية الذيل من الإثارة الطيف CFP المانحة، في حين أن 405 نانومتر تقع في ذروة الإثارة. بدلا من ذلك، يمكن أن يسمح التعبير التحقيق لاستعادة ليوم واحد. استخدام تحقيقات الثنائية يقلل القضايا حساسية للاختلافات في مستويات التعبير ونشر الجزيئي للالمانحة ومتقبل fluorophores. ويمكن استخدام المجسات غير الثنائية، ولكن مع SE بدلا من التصوير بورصة قطر وتصحيح إضافي لطيفي تنزف من خلال الإثارة وانبعاث الطيف (أنظر أدناه). وعلاوة على ذلك، توفر التجاري منخفض والتعقيد في تصميم تحقيقات الحنققد يكون عائقا. العامل الأكثر أهمية للتجارب ناجحة يبقى التصحيح السليم وتحليل الاشارات مضان.
ويستخدم لحساب بديل من نسبة الحنق لعدة أسباب إضافية إلى جانب التقليل من photobleaching من. لتحقيقات سلسلة واحدة ثنائية، نسبة شيوعا هي الانبعاثات متقبل تحت الإثارة المانحة (توعية الانبعاثات، SE) إلى انبعاث المانحة تحت الإثارة المانحة (مروي الانبعاثات، QE)، أي الحنق نسبة = SE / QE 25،47،48. SE / QE هو غير الخطية نسبة إلى تغييرات في كفاءة الحنق 21،22،47. وهي نسبة لها علاقة بشكل كبير غير الخطية لكفاءة الحنق الأصيلة في التحقيق (المنظمة الدولية للتعليم) (Donius، AE، Taboas، JM عمل غير منشور. (2015))، مع نسبة معظم الخطية لالمنظمة الدولية للتعليم أقل من ما يقرب من 15٪. سوف SE / QE نقلل أيضا جزء من تحقيقات المنشط (FAP، أي جزء من تحقيقات تحليلها ملزم). Therefoإعادة، تحليل SE / QE يتطلب التوازن جرعة مرهقة دراسة استجابة ومنحنى مناسبا. لحسن الحظ، ونسب SE أو التيسير الكمي إلى انبعاث متقبل تحت الإثارة متقبل (AEM) هي الخطية فيما يتعلق المنظمة الدولية للتعليم وFAP، أي نسب الحنق SE / AEM وQE / AEM. وكثيرا ما يستخدم SE / AEM لتحقيقات الثنائية ويتطلب فقط معايرة نقطة النهاية (في أي نشاط التحقيق والنشاط التحقيق الكامل)، ولكن الإشارات الخلوية القاعدية يجعل ذلك صعبا. للقضاء على الحاجة لمعايرة نقطة النهاية، SE يمكن تصحيحه (CSE) لتداخل الأطياف من الجهات المانحة والإثارة متقبل والانبعاثات أطياف (الطيفي تنزف من خلال) والعائد الكم والحساسية الطيفية (QS) من fluorophores التحقيق جنبا إلى جنب والمجهر نظام التصوير. نسبة SE الحنق تصحيح على أساس CSE تحدد كفاءة الحنق لاحظ من تحقيقات في كل بكسل من الصورة، أي E SE = CSE / AEM. البرمجيات التجارية ومجانية متاحة لتصحيح SE لهذه الآثار ويشار إلى القارئ إلى العمل تشن وPeriasamy 2006 للحصول على شرح مفصل للطرق 50. ومع ذلك، وحساب E SE يتطلب القبض على ثلاثة قنوات الصورة في الوقت نقطة (SE، بورصة قطر، AEM). لذلك، في هذا العمل كما قمنا بتوظيف نسبة الحنق بديلة E QE = 1 – أسهم / الأرصاد الجوية للطيران، الأمر الذي يتطلب القبض على اثنين من قنوات الصورة فقط (QE وAEM). حساب QE E من هذه القنوات لا يتطلب سوى تصحيح AEM لQS (الأرصاد الجوية للطيران = AEM س QS). ويقدر QS = ماركا المانيا / AEM بسهولة باستخدام اثنين من الصور من العينة معايرة واحدة، حيث ماركا هو انبعاث المانحة تحت الإثارة المانحة مع ابيض متقبل. ويندرج في أي لحظة يمكن أن تحسب بمقارنة E SE أو E بورصة قطر إلى المنظمة الدولية للتعليم من التحقيق.
في نهاية المطاف، الحنق اختيار نسبة (E SE = CSE / AEM مقابل E QE = QE / الأرصاد الجوية للطيران) ينبغي أن تقوم على النظر في نوع التحقيق والقنوات مع أفضل إشارة. على حد سواءتشمل pproaches خلفية تصحيح الضجيج من الصور في الإطار كما هو موضح أعلاه لمراعاة التغييرات في تألق ذاتي مع مرور الوقت. أنها تفترض أي تداخل من AEM ضوء الإثارة في الطيف الإثارة ماركا المانيا، كما هو الحال المستحقة للتحقيق في تصميم والمجهر مرشح التكوين في كثير من الأحيان. يمكن تحقيقات واحدة سلسلة استخدام أي ويستند الاختيار على أفضل إشارة التحقيق (السطوع) للضوضاء الكاميرا وإشارة أساسية عن SE وقنوات التسهيل الكمي. لجنة التحقيق ICUE1 والظروف التجريبية المستخدمة هنا (الخلية وهيدروجيل أنواع)، SE لديه إشارة أقوى من التيسير الكمي. تتطلب تحقيقات مزدوجة سلسلة استخدام E SE بسبب التوزيع غير متساوي المولية من الجهات المانحة ومتقبل fluorophores. للتحقيقات التي تقلل في الحنق على ملزم تحليلها مثل ICUE1، الحنق الكفاءة يمكن أن يكون "مقلوب" لتقديم تغيير الإشارات الإيجابية على ربط تحليلها كما نفعل هنا، مع E SE = 1 – CSE / AEM أو E QE = QE / (AEM س QS).
تحليل الالبريد يندرج حساس للتصويب السليم للنسب الحنق والتقدير من المنظمة الدولية للتعليم. يمكن تقدير مع نفس العينة المعايرة تستخدم لQS ونقطة النهاية التقليدية الحنق فحص الكفاءة كما المنظمة الدولية للتعليم = 1- (QE / ماركا المانيا) (صورة QE تليها photobleaching من متقبل وصورة ماركا المانيا) 28، ولكن يجب الحرص على تقليل تبيض عرضية من الجهة المانحة. نحن تصف نسخة معدلة حيث يتم استبدال تقدير ماركا استنادا AEM تعديل لQS، أي المنظمة الدولية للتعليم = 1 – (QE / (AEM س QS)). بالتناوب، المنظمة الدولية للتعليم = CSE / AEM يمكن استخدامها. يتطلب تقدير المنظمة الدولية للتعليم في الخلايا الحية أن يكون الدافع وراء كل تحقيقات لالحنق الكامل. وهذا أمر يصعب تحقيقه عمليا للتحقيقات، مثل ICUE1 التي تقلل في الحنق على ربط تحليلها. لحساب في المختبر على أساس من المنظمة الدولية للتعليم باستخدام الخلية لست] وتحليلها النقي هو أفضل، ولكن خارج نطاق هذا العمل. نحن هنا ننصح باستخدام 2 "، 5'-Dideoxyadenosine لتقليل المخيم في الخلايا. ومع ذلك، يجوز للFAP النسبي بالبريد حسابها باستخدام تقديرات المنظمة الدولية للتعليم المستمدة من مستوى خط الأساس من الإشارات. لهذه الأسباب، دراسات في معظم الأحيان بالإبلاغ عن نسبة الحنق (كما فعلت هنا) أو ما يندرج النسبي على أساس المعايرة نقطة النهاية، حيث الأساس يشير قبل إضافة ناهض هو الأدنى وإشارة بعد إضافة ناهض الثاني الذي يشبع الإشارات هي العليا مقيد. وكثيرا ما يستخدم Forskolin كما ناهض التحكم لتشبع إشارة المخيم. بدلا من ذلك، يمكن استخدام التناظرية المخيم مثل 8 Bromoadenosine 3 "، الأدينوزين 5'-دوري. ينصح الضوابط الإيجابية المستخدمة عند الانتهاء من الدراسات لتحديد التغييرات المحتملة في مسار الإشارات بين علاجات تجريبية.
حساب متوسط استجابة الإشارات لكل خلية يتطلب النظر في عدة عوامل. أولا، يجب أن يحسب متوسط نسبة الحنق على أنه متوسط النسب في كل بكسل داخل الخلية، أي (Σ (QE/cAem)) / (عدد البكسل)، بدلا من راتيو من متوسط بورصة قطر وAEM في خلية، أي (ΣQE) / (ΣcAem). على الرغم من أن هذا الأخير لا يحتاج اخفاء دقيق ضجيج منخفض، فإنه يقلل كثيرا من متوسط الحقيقية نسبة الحنق. ومع ذلك، نسب بكسل تتطلب حساب الفاصلة العائمة واخفاء ثنائي دقيق لمساحة الخلية لتحديد رويس وتجنب إدراج نسب زائفة الناتجة عن الضوضاء الخلفية خارج الخلية. يجب أن يكون كميا المنطقة الخلية بأكملها لتجنب يتحامل النتائج على شكل الخلية. قد يحتاج اخفاء إلى إعادة تعريف بمرور الوقت اعتمادا على التغييرات في شكل الخلية والهجرة. بالتناوب، رويس أكبر من الخلايا يمكن استخدامها في حالة عدم تعريف معايير الاستبعاد لإزالة نسب بكسل من التيسير الكمي وإشارات AEM التي تقع أقل بكثير من مستويات الخلايا وتكون مستويات الخلفية القريب. ووصف أساليب التحليل بالتفصيل الخطوات الأساسية المستخدمة في هذا العمل لتحليل الحنق بدون برامج / الإضافات المتخصصة. المصنعين المجهر وغيرها من البائعين بيع إضافة على وحدةالصورة للبرمجيات المجهر، والتي تدعم ratiometric الآلي والحنق التحليل. وبالمثل، فإن برنامج ImageJ المجال العام لديها العديد من الإضافات المتاحة للالجسيمات وتحليل الحنق، مثل RiFRET. وثانيا، فإن متوسط نسبة الحنق بكسل القائم تقلل من شأن متوسط نسبة حقيقية من الهيكل الخلوي 3D لأنه يستخدم صورة 2D. إشارات 2D تمثل والمتوسط على طول محور ض. حساب التوزيع المكاني 3D نسب الحنق في الخلايا الحية غير ممكن دون سرعة عالية التصوير 3D (على سبيل المثال، باستخدام الغزل القرص المجهري متحد البؤر). هذه هي مشكلة لكل من 2D و 3D الثقافات، ولكن له تأثير أكبر في 3D كما أكثر من الهيكل الخلوي موجودا من الطائرة. هذا هو مصدر قلق كبير للتحقيقات أن توطين الهياكل الخلوية، مثل غشاء البلازما EPAC1 التحقيق مساء ICUE. انظر Spiering وآخرون. 2013 للحصول على اقتراحات لتصحيح آثار سمك خلية في حسابات نسبة 24. تحليل توزيع AEM يمكن استخدامها لالكشف عن حالة يتراكم التحقيق في مناطق الطائرة الخلية والتصوير تعديل. وهذا سوف يساعد أيضا في تفسير التوزيع المكاني للنسب الحنق والقضاء على نتائج زائفة، على سبيل المثال، تحديد مسبار التشبع (أي سوف منطقة AEM منخفضة يكون تركيز التحقيق منخفضة ويمكن أن يحمل التشبع التحقيق ونسبة الحنق عالية). قد تشير مختلف المستويات الثالثة، الحنق خط الأساس فرق في كفاءة ترنسفكأيشن، تسبر التعبير، أو إشارات القاعدية بين المجموعات التجريبية. "تحليل نسبي" (الخطوة 10.1.1) يساعد على إزالة الانجراف في نسبة الحنق على مر الزمن إذا كان موجودا. فهو يسهل المقارنة بين حجم النسبي لاستجابات بين العينات، ولكن يعوق بالمقارنة مع الوقت طبعا الاستجابة لعينة مرجعية (مراقبة المؤامرة هي على خط مستو). "تحليل المطلق" (الخطوة 10.1.2) يسهل المقارنة بين معدل استجابة عبر العينات، ولكن يعوق المقارنة بين حجم الاستجابة ليتم تحجيم كل سطر من قبل dissimثابت ILAR. وغالبا ما تستخدم دراسات الانحدار الخطي على خط الأساس لتصحيح الانحراف في نسبة الحنق على مر الزمن.
طريقة 3D الحنق وصفه هو وسيلة مفيدة وعملية لصنع وتنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الهلاميات المائية 3D لادن، والتي يمكن تطبيقها لتحقيقات أخرى وطرائق التصوير. وغيرها من نظام الحنق إلى جانب سلسلة واحدة تحقيقات الثنائية تتطلب المزيد من تصحيح معقدة من الإشارات كثافة القائمة على النحو المذكور أعلاه. بالتناوب، مضان العمر التصوير من الحنق (FLIM-الحنق) يمكن أن تستخدم لحساب الكفاءة الحنق عن طريق التغيير في حياة الانبعاثات من الجهات المانحة التحقيق. على عكس الحنق كثافة مقرها، FLIM-الحنق غير حساس للضجيج في الخلفية، الطيفي تنزف من خلال والكفاءة الكم، وكشف عن الحساسية الطيفية 2. ومع ذلك، نظم فليم مكلفة ومعقدة، وغير المألوف، وتعمل بشكل أفضل مع fluorophores مع تسوس الأس واحد وليس FLIM الاعادة 49. ويمكن أيضا أن تستخدم الطريقة الموصوفة مع موإعادة منصات المجهر المتقدمة (على سبيل المثال، الحنق، TIRF، تباين مضان، والأطياف الحنق الارتباط). إن تطبيق هذه الطريقة لتصوير 3D مع سرعة عالية متحد البؤر والفحص المجهري multiphoton تسهيل تحليل التوزيع الفرعية الخلوي للاستجابة الإشارات وزيادة دقة مما يشير التحليل. وهذه الطريقة سوف 3D الحنق تمكن دراسات بيولوجيا الخلايا المتقدمة في microenvironments الخلوية 3D المحاكاة. على هذا النحو، ويمكن تطبيقه بسهولة إلى الأدوية والاحتياجات الطب التجديدي، بما في ذلك دراسة الإشارات بين الخلايا وفحص الاستجابة للدواء في microtissues القائم هيدروجيل هندسيا.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون تقر بدعم مالي من كلية طب الأسنان في جامعة بيتسبرغ، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة K01 AR062598، وDE030740 منحة P30. أشكر الكتاب أيضا الدكتور جين تشانغ لالبلازميد ICUE1، واين Rasband لتطوير يماغيج ومايكل Cammer للماكرو يماغيج.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] | Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) | NC0162601 | Reagents |
| Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) | Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich | 95904 | Reagents |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514 | Reagents |
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 440167 | Reagents |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470-5g | Reagents |
| 2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride | Fisher Scientific | AC244280100 | Reagents |
| 2-Butanone | Fisher Scientific | AC149670010 | Reagents |
| Lithium Bromide | Fisher Scientific | AC199871000 | Reagents |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 190764 | Reagents |
| Sigmacote (siliconizing reagent) | Sigma Aldrich | SL2 | Reagents |
| Toluene | Fisher Scientific | AC36441-0010 | Reagents |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH3025601 | Reagents |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) | Life Technologies | 11058-021 | Reagents |
| FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) | Promega | E2311 | Reagents |
| Cellstripper (cell dissociation solution) | Corning | 25-056-CI | Reagents |
| Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free | Corning | 356231 | Reagents |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Reagents |
| Pipette Tips (10,200,1000 μl) | Fisher Scientific | 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 | Disposable lab equipment |
| Powder Free Examination Gloves | Fisher Scientific | 19-149-863B | Disposable lab equipment |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Disposable lab equipment |
| Biopsy punch (3 mm) | Miltex | 3332 | Disposable lab equipment |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-544C | Disposable lab equipment |
| Precoated glass coverslips (epoxysilane) | Arrayit | CCSL | Disposable lab equipment |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12550D | Disposable lab equipment |
| Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) | Fisher Scientific | 14-959-70C, 14-959-49A | Disposable lab equipment |
| Cell culture dish (6-well) | Falcon | 351146 | Disposable lab equipment |
| Epifluorescent Microscope with motorized stage | Nikon | MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) | Large/non-disposable lab equipment |
| Adjustable Specimen Holder for XY Stage | Nikon | 77011393 | Non-disposable lab equipment |
| 60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) | Nikon | MRD01605 | Non-disposable lab equipment |
| CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) | Nikon (Sutter Instrument reseller) | 77016231, 77016088 | Non-disposable lab equipment |
| CYF/YFP filter set | Nikon (Chroma Technology Corp) | 77014928 | Non-disposable lab equipment |
| Camera (ORCA Flash 4.0 v1) | Nikon (Hamamatsu reseller) | 77054076 | Non-disposable lab-equipment |
| NIS-Elements 40.20.02 microscope software) | Nikon | MQS31100 | Non-disposable lab equipment |
| Prism (spreadsheet and graphing software) | GraphPad Software, Inc | Version 6 | Non-disposable lab equipment |
| OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) | OmniCure | S1000 | Large/non-disposable lab equipment |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | DP-100 | Non-disposable lab equipment |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | Reichert Bright-Line 1475 | Non-disposable lab equipment |
| Vacuum desiccator chamber/degasser | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Tissue Culture Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Chemical Fume Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Oven | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Spatula | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Beaker | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Incubator | Any | Large/non-disposable lab equipment |
References
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
- Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
- Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
- Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
- Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
- Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. . Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , (2014).
- Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
- Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O., Capri, A. . Progress in Molecular and Environmental Bioengineering – From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. , 117-149 (2011).
- Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
- Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
- Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
- Kikuchi, K., Nagamune, I. E. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. 119, 63-78 (2010).
- Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
- Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
- Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators – Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
- Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
- Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
- Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
- Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
- Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
- Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
- Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
- Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X., Burdick, J. A., Mauck, R. L. . Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. , 9-46 (2011).
- Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
- Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
- Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , (2014).
- Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
- Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
- Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).
