3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET
Summary
포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.
Abstract
포스터 공명 에너지 전달 (FRET)의 영상은 실시간으로 세포 생물학을 검사하기위한 강력한 도구이다. FRET을 이용한 연구는 일반적으로 3 차원 (3D) 세포 미세 환경을 모방하지 않고 2 차원 배양을 사용한다. 차원 겔 환경 내 세포의 위드 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 켄칭 발광 FRET 이미징을 수행하는 방법이 제공된다. 여기서 프로브 활성화 범위 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석 방법을 설명한다. 세포 내 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 수준의 측정은 EPAC1 활성화 (ICUE1)과 하이드로 겔 재료의 종류, 본원 광 가교 하이드로 겔 (PC – 겔법에 따라 시그널링 된 cAMP의 차이를 검출 할 수있는 능력에 대한 프로브를 사용하여 포스 콜린 자극 하에서 연골 세포에서 증명되고 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트)와 thermoresponsive 하이드로 겔 (TR-GEL). 2D FRET 방법과 비교하여,이 방법은 약간의 추가 작업이 필요합니다. 이미 2d에 FRET 영상을 이용하여 실험실 쉽게 3 차원 미세 셀에 대한 연구를 수행하기 위해이 방법을 채택 할 수있다. 이것은 더 설계 차원 microtissues 높은 처리량 약품 스크리닝에 적용될 수있다. 또한, 이러한 이방성 측정 및 형광 수명 이미징 (FLIM)과 같은 고급 공 초점 현미경을 사용하여 플랫폼 펄스 또는 변조 된 조명 FRET 촬상 다른 형태와 호환 가능하다.
Introduction
셀룰러 신호는 복잡하고 약리학, 조직 공학, 재생 의학 등 다양한 분야에 대한 필연적 모두이다. 유용한 임상 도구는 세포 생물학에 대한 우리의 이해를 촉진하고 조직 재생을위한 최적의 재료를 개발하기 위해 필요하다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 이미징 수용체 활성화 분자 형태 및 생균의 초분자 상호 작용 (예., 단백질 / DNA 착화)의 분석을 가능하게하는 중요한 도구이다. FRET는 형광 물질 (1) 사이 비 복사 에너지 전달의 유형이다. 이 도너 형광 물질 및 형광 수용체 사이의 거리의 여섯 번째 전력에 반비례 효율을 갖는다. (- 10 nm의 통상적 1) 2 따라서, 나노 미터 크기의 두 개의 다른 분자 사이 또는 한 분자의 영역에 걸쳐 공간적 거리 정보를 제공 할 수있다. 기증자 및 수용체 형광 다른 m 할 수있다olecule 타입 도너는 높은 에너지 방출 (단파장)가있는 (헤테로 FRET), 또는 같은 형태의 (호모 FRET). FRET 영상은 고정 또는 살아있는 세포에서 수행 할 수 있지만, 고속 촛점 시스템을 사용할 때 일반적으로 고정 된 세포는 높은 공간 해상도에서 분자 상호 작용의 영상화에 사용된다. 생균 등의 반응 3 시그널링 실시간 세포 등의 억제 나 고정에 의해 변경되는 상호 작용과 프로세스를 연구하기 위해 사용된다.
채용 생균 연구 때문에 간단하고 낮은 배경 (평면 세포 밖으로 방출에서 아니오)의 일부 촬상 사용을 2 차원 세포 배양 FRET. 그러나, 2 차원 배양은 생리적 및 미세 3 차원 배양 4,5- 비해 다양한 세포 과정을 변경. 예를 들어, 세포 외 기질 상호 작용에 셀과 셀 기본 셀은 크게 EAS에 이르는 2D 문화에 변경된다ILY는 세포 형태와 극성 (6)의 변화를 관찰했다. 그들은 골격 성분 7,8과 셀 형상 및 골격 구조가 강하게 공간 배양 환경 (9)에 의해 규제되는 결합 때문에 막 마이크로 도메인 (예., 카베 올래 지질 래프트) 및 수용체 신호 강하게 부분적 배양 환경에 의해 조절된다. Mechanotransduction은 3 차원 매트릭스에 의해 좌우되지만보다 복잡한 차 적재 상태로 2 차원 배양 물 (10)에 비해 3 차원 환경에서 생기게하지 않는다. 마지막으로, 3 차원 매트릭스의 투과성은 확산을 감소 차원 배양에 비해 신호 분자 세포의 결합을 증가와 함께, 일반적으로 배지 미만이다. 3D를 배양 한 접착제, 화학적 및 기계적 큐에 대한 생리적 더 유사한 미세 환경을 생성하고 관찰 할 수있다. 전지 셀 상호 작용을 촉진 할 수 있고, 접착 특성 w를 제어 할 수있다차원 재료 11-13의 구조 조성, 및 구조 (패터닝) 번째. 재료의 기계적 특성을 마찬가지로 조성 및 구조 (14, 15)에 의해 조정될 수있다. 하이드로 겔에서 세포를 배양 따라서 허가 그렇지 않으면 해제 차별화 것이 일차 전지 또는 기존 기술을 사용하여 표현형의 변화, 예에 대한 연구를 FRET., 관절 연골의 세포를. 따라서, 방법은 라이브 3D 배양에서 FRET 분석을 가능하게하는데 필요하다.
그들은 광학적으로 투명하게하고, 미세 제어하는 셀룰러 신호를 제공하도록 맞추어 질 수 있으므로 하이드로 겔 지지체는 3D FRET 기초 연구에 적합하다. 천연 고분자로 만든 하이드로 겔은 젤라틴과 섬유소 (16)를 포함하여 수십 년을위한 세포 배양에 사용되어왔다. 세포 미세 환경을보다 컨트롤이 고분자의 화학적 변형과 합성 고분자 (17, 18)의 사용으로 달성 될 수있다. HYDR기계적 강성 ogel 투자율들은 폴리머 조성을 변화시킴으로써 제어 할 수 있고, 사이즈 (중합체 및 가교 밀도) 19, 20 메쉬. 또한, 하이드로 겔은 성장 인자 및 세포 리간드의 결합을 통해 생리 활성을 할 수있다. 때문에 이러한 가능성을, 바이오 센싱, 약물 전달 및 조직 공학 응용 프로그램에 대한 하이드로 겔의 개발 연구 (21)의 매우 활동적인 영역이다. 하이드로 겔의 3D 프린팅은 미세 조직의 제조를 위해 개발을 진행하고 15 -organs된다. 따라서, 하이드로 겔의 셀 FRET 촬상 생리적 셀룰러 동작을 근사화하는 수단으로서 유용하지만, 또한 연구 및 설계 조직 성장을 최적화하기위한 도구로써뿐만 아니라.
이진 비율 적 FRET 프로브는 셀룰러 신호를 연구하는데 유용하며, 하이드로 겔 배양에 활용 될 수있다. 게시 된 형광의 일부 목록 및 프로브를 FRET, 셀 마이그레이션 컨소시엄 웹 사이트를 참조하십시오 <sup> 22. 가장 일반적인 프로브 타입은 인식 요소 (들) (피검 감광 영역)에 의해 연결된 또는 연결되어있는 두 개의 서로 다른 형광 물질을 포함한다. 이들 영역은 형광 따라서 FRET 크기 (높거나 낮은) 사이의 거리를 변경한다 (이온 또는 분자의 영역의 효소 분해의 결합 예). 분석 물질의 검출시에 형태 적 변화를 연결 또는 연결 해제를 거쳐 23. 덜 일반적인 아직 유용 프로브 유형은 FRET의 크기를 변경하는 두 형광의 스펙트럼 중첩의 분석 민감한 변화에 의존한다. "단일 쇄"비율 적 프로브는 단일 분자에 연결된 형광 쌍을 이용한다. "이중 쇄"프로브는 개별 분자에 형광 쌍을 이용하지만, 그 표현은 동일한 발현 카세트 (24) 아래에 연결될 수있다. 단일 형광 식 연구 (예., 형광 융합 단백질), 연구 비율 적으로 달리FRET 프로브는 형질 전환 효율 또는 세포 생존에 대한 제어 이중 형질 전환이 필요하지 않습니다. 최소 임계 값 (문자를 구분 농도) (23, 25) 위의 표현하면 비례 FRET 프로브는 형질 전환 효율이 상대적으로 문자를 구분하지 않는다. 그들은 여기 소스 변동 및 기타 세포 내 환경 요인 (예., 산도, 이온) 너무 오래 두 형광 유사하게 반응하는로에 민감하다. 형광체 및 발광 생물 프로모터 리포터 (26, 27)를 구성 달리 또한, 이들 반응은 전사 지연을받지 않는다.
비례 FRET 프로브는 쉽게 자주 위드 종래의 표면 형광 현미경 시스템에 사용된다. 위드 현미경 때문에 시스템 비용, 형광 표백, 충분한 시간 해상도와 신호 변경의 캡처에 대한 우려의 라이브 세포 이미징을위한 라인 스캔 공 촛점 시스템에 비해 바람직하다. 또한, 단일 세포 항문세포의 큰 인구 이상이 Analysis보기의 여러 분야에 걸쳐 전동 무대 및 이미지 캡처 가능합니다. 위드 현미경은 이종 FRET 프로브 신호의 강도를 기반으로 분석을 필요로한다. 강도의 분석은 FRET 다른 방법과 같은 복잡한 하드웨어를 필요로하지 않지만,보다 취득 후 작업은 형광 현미경 동작 및 / 영상 시스템 구성 (28)의 영향을 보정하기 위해 필요하다. 형광의 촬상 발광 강도의 여기 에너지의 함수, 형광 양자 수율 및 결합 필터 및 카메라 / 검출기 분광 감도 및 선형성이있다. 이러한 도너 및 수용체에 대한 이종 수 있고, 정량 분석을 위해 교정을 필요로한다. 또한, 억 셉터 발광 이미징 (도너 여기 광에 의해 수용체의 여기 및 블리드 스루 도너 발광을 수용체에 발광 스펙트럼)을 형광체의 스펙트럼 오버랩에 의해 영향이.4, 단일 체인 이중 체인 "프로브 셀 25, 28을 통해 다른 화학 양론에 존재할 수있는 경우의 형광." "프로브의 형광이있는 동안, 자신의 형광체는 나노 스케일에서 몰 있기 때문에 내부적으로 정규화"단일 체인 " 프로브는 유사한 밝기 (흡광 계수 및 양자 수율의 작용), 비선형 검출기 감도의 효과는 배경 형광 (23)을 필요로하는 접속의 양자 수율 / 검출기 감도 작은만을 보정이다의이다. 따라서, "단일 쇄" 비율 계량 FRET 프로브는 쉽게 위드 현미경 (24)에서 구현됩니다.
본 논문은 기존의 위드의 epifluorescent 현미경을 사용하여 3D 하이드로 겔 문화의 살아있는 세포의 FRET 이미징을 수행 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 쉽게 이미 2D에서 FRET 실험뿐만 아니라 간에 관심이 실험실을 수행하는 실험실에 의해 채택 될 수있다microtissues에서 세포 신호. 여기서 우리는 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 광 가교 내의 실제 연골 세포의 레벨 (PC 겔, 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트)와 thermoresponsive (TR-겔, 마트 리겔) 하이드로 겔의 FRET 촬상 계와 측정 방법을 보여준다. 율 비교 FRET 프로브는 포스 콜린, 캠프 ATP의 전환을 촉매 아데 닐 레이트 사이 클라 제에 대한 화학 작용제에 대한 응답의 cAMP 수준을 검출 EPAC1 (ICUE1)에 기초하여 이용된다. 캠프는 G 단백질 결합 수용체의 신호 전달을 매개하는 주요한 두 번째 메신저 중 하나이며 직접 캠프 (EPAC를)에 의해 활성화 하류 교환 단백질 등 다양한 요소를 활성화합니다. 형광 캠프는 FRET의 감소의 결과로 EPAC 도메인에 바인딩에 떨어져 이동합니다. 3D 하이드로 겔의 셀의 하이드로 겔 물질의 제조 상기 ICUE1 프로브가 세포 형질 전환 및 매립은 여기에서 설명한다. 차원 FRET 실험 절차 및 필요한 이미지 분석셀 당 프로브 활동이 설명되어 평가한다. 우리는 또한 위드 현미경을 사용하여 2D 및 3D에서 FRET 분석의 본질적인 한계에 대해 설명합니다. 그것보다 생리적 환경에서 분석을 가능하게 적은 화상 보정 및 교정을 필요로하기 때문에 여기에 제시된 기술은 기존의 2D 방식에 비해 개선 된 것이다. 그레이트 유틸리티 셀 형질 환경이 유지 될 수 있지만 많은 투명 재료가 이용 될 수 있다는 사실에있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 FRET 영상이 3D 하이드로 겔에서 세포 신호를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이전 연구 하이드로 겔 (38)와 세포 상호 작용의, 하이드로 겔 기판 35-37에 씨앗을 품고 세포의 FRET 영상을 시연하고, 하이드로 겔 39-41에 갇혀 분자 있지만,이 안에 포함 된 세포의 FRET 영상 기반 세포 분석을 서술 한 최초의 출판물입니다 3D 하이드로 겔. 2D에서 3D로 FRET 영상을 변환 할 때 작업은 몇 가지 구현 문제를 해결합니다. 먼저, 높은 개구 목적은 충분한 발광 신호를 수집 FRET 촬상 필요하지만, 필드의 깊이를 제한한다. 여기에서 세포는 다소이를 보상하기 위해, 유리 근처 초점면에서 세포의 수를 증가 통해 원심 침강된다. 둘째, 3 차원 하이드로 겔 지지체는 분석을 복잡 촬상시 시야에 걸쳐 드리프트 할 수있다. 하이드로 겔은 여기 COV 결합한erslip 그들은 실험을하는 동안 고정 된 상태를 유지하도록. 하이드로 겔은 세포의 가시화를 방해 할 수 있기 때문에 3 차원 FRET 적합한 하이드로 겔 조성물 셋째, 선택은 필수적이다. PC-젤 TR-겔 여기에 투명 하이드로 겔이 사용된다. 그러나, 커버 슬립 가까운 초점면 원심 분리로 세포를 수집은 하이드로 겔 diffraction.The 선택은 하이드로 겔 (42)의 리뷰에서 찾을 수 시뮬레이션해야 미세 환경 조건에 따라 그 이상 하이드로 겔의 이미지 셀에 사용될 수있다 . 넷째, 다른 계산은 단일 쇄 ICUE1 프로브의 FRET 비율 (즉, E QE = QE / CAEM)는 분석에 필요한 화상 채널의 수를 최소화함으로써, 광표백을 최소화하기 위해 여기에 사용된다. 셀당 평균 FRET 비율은 실제 FRET 비가 과소 평가를 최소화하기 위해 셀 내의 화소 당 비율의 평균으로 산출된다. 마지막으로, 선형 비율 적 분석 수단단일 쇄 이진 프로브의 활성 분획을 계산하는 것이 기재되어있다.
위드 현미경을 사용하여 성공적 FRET 실험을 수행하는 여러 가지 중요한 측면이있다. 하드웨어와 관련하여, 카메라는 새로운 과학 CMOS 카메라 및 CCD를 종래보다 더 적합한 전자 승산 CCD를두고 작은 신호 변화를 해결하기에 충분히 민감해야한다. 가장 FRET 비의 공간 분포를 분석하기 위해, 카메라는 최소 두 배의 대물 (나이 퀴 스트 기준)의 점 확산 함수의 공간 해상도를 가지고 있어야. 이 작업에 듀얼 뷰 시스템은 덜 적합하다. 더 중요한 형광 물질의 광표백을 최소화하기 위해 주어진 FRET 쌍 적절한 노광 및 이미지 획득 율을 선택한다. 감소 수집 속도는 실험 기간이 증가할수록 좋습니다. 빠른 필터 휠의 사용은 포착 율 분석하면서 피 용 영상 범위의 개수를 늘려듀얼 뷰와 터렛 필터 큐브와 이미지 등록 문제를 보내고. 불균일 조명 필드는 샘플 자기 형광 카메라 시스템 잡음에서 발생 배경 형광에 대한 정정을 복잡하게한다. 일부 히드로 겔은 특히 콜라겐 단백질을 함유하는 것을 43,44 매우 autofluorescent이다. 프렛 비율은 배경 보정없이 과소 평가한다. 여기에서는 주로 영상 (도 3b의 단계 7.2)의 중심 위에 에피 형광 조명으로 구성 할 수있는 비교적 평탄한 조명 필드에 의존하는 단순 배경의 보정 방법을 사용한다. 이 방법은 따라서이 조명 분야 내에서 그 관심의 세포를 제한합니다. 여기에 설명 된 배경 보정은 바이너리 프로브 읽기 파장 세포자가 형광을 고려하지 않습니다. 이러한 경우에, 표지 된 세포 (NO 프로브 형질) 감산 같은 조건으로 배경에서 묘화한다. m표지 및 표지 된 세포의 IX가 사용될 수 있고, 비 표지 세포 백그라운드 ROI 선택. 전체 이미지 필드 위에 세포 분석을 제공하는 다른 방법이 세포가없는 음영 마스크의 사용, 여러 배경 로아, 또는 동일한 샘플을 포함하는 프로토콜 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
3D FRET 촬상 특정 프로브 응답은 분석 물질 (도 6)에 하이드로 겔 투과성에 매우 민감하다. 따라서 동일한 하이드로 겔 영역은 바람직 형상 대칭의 시점에서 이러한 여기에 사용 된 발판 센터 근처로, 실험적인 치료를 통해 비교된다. 다르게는, 미세 유체가 챔버 / 생물 신속하고 균일 검체 용액 (45) 하이드로 겔을 관류하는 데 사용될 수있다. 프렛 신호는 하이드로 겔의 형광도가 너무 높은 경우 (신호 대 잡음 비율이 너무 낮은 경우) 검출되지 않을 수있다; 얇은 하이드로 겔 또는 다른 프로브 (다른 형광체)를 사용한다.광 가교 하이드로 겔의 3D FRET 영상에 대해, 최소 방사선 노출과 프로브의 형광의 여기 스펙트럼 외부의 파장을 사용하는 것이 좋습니다. LAP는 또한 잠재적 인 세포 손상을 최소화 31,46 405 nm에서의 가시광 원으로 사용될 수있다. 이 프로브 표백을 최소화하기 때문에, 365 nm의 조사에 사용 LAP 권장합니다. 피크 여기에 놓여 405 내지 365 nm 인 반면는 CFP 공여체 여기 스펙트럼의 말미에있다. 대안 적으로, 프로브 식 하루 동안 회복하도록 허용 될 수있다. 이진 프로브의 사용은 발현 수준 및 도너와 억 셉터 형광 분자 확산에 차이가 감도 문제를 최소화한다. 비 이진 프로브를 사용하지만, SE 대신 여기 및 발광 스펙트럼 스펙트럼 블리드 스루에 대한 QE 이미징 및 추가 수정과 (아래 참조) 할 수있다. 또한, 저 상용화와 FRET 프로브 설계 복잡성방해가 될 수있다. 성공적인 실험에서 가장 중요한 요소는 형광 신호를 적절히 보정 분석 남아있다.
프렛 비율 대체 계산 광표백 최소화 외에 여러 추가적인 이유로 이용된다. 이진 단일 체인 프로브의 경우, 일반적으로보고 된 비율은 기증자 여기 (급냉 방출, QE), 즉 아래 기증자 방출에 기증자 여기 (증감 방출, SE)에서 수용체 방출은, 비 = SE / QE 25,47,48를 FRET. SE / QE는 FRET 효율 21,22,47의 변화에 비선형 상대적입니다. 즉, 비 프로브 (EI)의 고유 FRET 효율성 지수 함수의 비선형 관계를 갖는다 (Donius, AE, Taboas, JM 미발표 작품. (2015)), 작은 약 15 % 미만 에이 대한 비율 가장 직쇄. SE / QE는 활성화 된 프로브 (FAP, 즉, 분석을 결합 프로브의 부분)의 비율을 과소 평가합니다. Therefo다시는 SE / QE의 분석은 복잡 평형 복용량 응답 연구와 곡선 맞춤을 필요로한다. 다행히 수용체 여기에서 수용체 방출에 SE 또는 QE의 비율 (AEM)가 즉, 에이와 FAP,에 대하여 선형의 FRET 비율 SE / AEM 및 QE / AEM. SE / AEM은 종종 이진 프로브에 사용 전용 (프로브 활동 및 전체 프로브 활동에서) 엔드 – 포인트 보정이 필요하지만, 기저 세포 신호 전달이 곤란하게된다. 엔드 보정에 대한 필요성을 제거하기 위해, SE는 도너와 수용체의 여기 및 발광 스펙트럼의 스펙트럼 중첩 (스펙트럼 블리드 스루)과 결합 된 프로브의 형광과 현미경의 양자 수율 및 분광 감도 (QS)에 대해 (CSE) 보정 될 수있다 이미징 시스템. CSE에 기초하여 보정 SE FRET 비율, 즉 화상, E = SE CSE / AEM의 각 화소 내에서의 프로브 관측 FRET 효율성을 정의한다. 상업 및 자유 소프트웨어는 이러한 효과 SE를 해결하는 데 사용할 수 있으며독자는 방법 (50)에 대한 자세한 설명은 첸과 Periasamy 2006 년 작품이라고합니다. 그러나, E SE를 계산하는 시간 점 (SE, QE, AEM) 당 세 개의 영상 채널의 캡처가 필요합니다. 두 개의 영상 채널 캡처 (QE 및 AEM)가 필요합니다 QE / CAEM, – 따라서,이 연구에서 우리는 또한 다른 FRET 비율 E QE = 1을 사용합니다. 이러한 채널에서 E의 QE 계산 만 QS (CAEM = AEM은 QS를 X)에 대한 AEM 보정이 필요합니다. QS = 민주 / AEM 쉽게 민주는 수용체 표백와 기증자 여기에서 기증자 방출되는 하나의 교정 샘플에서이 이미지를 사용하여 추정된다. 임의의 순간에 FAP는 프로브의 에이 SE에 E 또는 E QE를 비교함으로써 계산 될 수있다.
결국 FRET 비 선택 (E QE = QE / CAEM 대 E SE = CSE / AEM)는 프로브 유형을 고려하여 최상의 신호 채널들에 기초한다. 모두시간이 지남에 따라 형광도의 변화를 계정에 전술 한 바와 같이 pproaches는 프레임 당 이미지의 배경 소음 보정을 포함한다. 그들은 종종 설계 현미경 필터 구성을 프로빙에 의한 경우가 민주 여기 스펙트럼으로 AEM 여기 광의 오버랩을지지 않는다. 단쇄 프로브 역시 사용할 수 있으며, 선택은, 카메라 잡음에 가장 프로브 신호 (밝기)과 SE 및 QE 채널의 배경 신호에 기초한다. ICUE1 프로브와 여기에 사용 된 실험 조건 (셀 하이드로 겔 타입)의 경우, SE는 QE보다 더 강한 신호를 가지고있다. 이중 쇄 프로브 인해 도너와 억 셉터 형광 비 등몰 분포 E SE의 사용을 필요로한다. 이러한 ICUE1으로 분석 결합에 FRET 감소 우리는 E SE = 1, 여기처럼 효율이 분석을 결합 할 때 긍정적 인 신호 변화를 제시하는 "반전"할 수 FRET 프로브 용 – CSE / AEM 나 E QE = QE / (AEM은 QS를 X).
일의 분석전자 FAP는 FRET 비율의 적절한 보정과 에이의 추정에 민감합니다. 그것은 QS에 사용 된 것과 같은 캘리브레이션 샘플 종래의 엔드 포인트와 FRET 추정 될 수 에이가 = 1- (QE 화상 수용체 광표백 및 민주 이미지 뒤에) 28 만, 치료가 취해 져야 (/ 민주이 QE)을 최소화하기 효율 분석 기증자의 실수로 표백. 우리는 QS 조정 AEM에 따라 민주의 추정, 치환 된 수정 된 버전을 설명 즉, 에이 = 1 – (QE /은 (AEM)는 QS X). 선택적으로, CSE = 에이 / AEM 사용할 수있다. 살아있는 세포의 에이의 평가는 모든 프로브 전체 FRET로 구동해야합니다. 이 분석 물을 결합에 FRET 감소 등 ICUE1 같은 프로브를위한 사실상 달성하기 어렵다. 세포 용 해물과 정제 분석을 사용하여 에이의 체외 기반으로 계산 최선이지만,이 작업의 범위 밖에. 여기에서 우리는 세포에서 캠프를 감소 2 ', 5'-Dideoxyadenosine를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 상대적으로 FAP가있다 ㄱ전자 신호의 기준 레벨로부터 유래 에이 추정을 사용하여 계산. 이러한 이유로, 연구는 대부분 작용제를 첨가하기 전에 시그널링 기준선 시그널링 포화 제 작용제를 첨가 한 후 하한 및 신호 인 엔드 보정에 기초하여 FRET 비 (여기 완료로) 또는 상대 FAP를 상부되어보고 경계. 포스 콜린 종종 된 cAMP 신호를 포화 제어 작용제로서 사용된다. 선택적으로, 캠프 유사체가 사용될 수있는 8- Bromoadenosine 3 ', 5'-시 클릭 모노 포스페이트 등. 실험적인 치료 사이의 신호 전달 경로의 잠재적 변화를 확인하는 연구의 완료에 사용 양성 대조군을 권장합니다.
셀 당 평균 신호 응답의 계산은 여러 가지 요인을 고려를 필요로한다. 우선, 평균 FRET 비율이 셀 내의 각 화소의 비율의 평균으로 계산한다, 즉 (Σ (QE/cAem)) / (화소 수) 대신 RA셀의 평균 QE 및 AEM, 즉, (ΣQE) / (ΣcAem)의 TIO. 배경 잡음이 낮은로 후자 조심 마스킹을 요구하지 않지만, 그것은 심각한 실제 평균 FRET 비가 과소. 그러나, 화소의 비율은 부동 소수점 계산과 ROI 영역을 정의하고 상기 셀 외부 배경 잡음으로부터 생성 된 스퓨리어스 비의 포함을 피하기 위해, 셀 영역의 바이너리 마스크주의를 필요로한다. 셀 전체 영역이 셀 형상에 부세 결과를 피하기 위해 정량한다. 마스킹은 세포의 모양과 이동의 변화에 따라 시간이 지남에 따라 재정의 될 필요가있다. 배타 기준이 QE 잘 세포 수준 미달 근처 배경 수준이다 AEM 신호로부터 화소 비율을 제거하도록 정의되는 경우, 또는, 상기 셀보다 큰 ROI를 사용할 수있다. 상기 된 분석 방법 세부 전문 소프트웨어 / 플러그인없이 FRET 분석을 위해 본 연구에 사용 된 기본 단계. 현미경 제조 업체 및 기타 업체는 추가 모듈 판매자동화 비율 계량을 지원하고 분석 FRET 자신의 현미경 소프트웨어에 대한의. 마찬가지로, 공개 ImageJ에 소프트웨어는 RiFRET 같은 입자와 FRET 분석을 위해 사용할 수있는 몇 가지 플러그인을 가지고 있습니다. 2 차원 화상이 사용되기 때문에 둘째, 픽셀 기반의 평균 FRET 비율은 3 차원 세포 구조의 실제 평균 비율을 과소. 2 차원 신호를 나타내고, z 축을 따라 평균. 생균의 FRET 비의 3 차원 공간 분포의 계산은 고속 3D 이미징없이 불가능하다 (예. 이용한 디스크 초점 현미경 회전). 이것은 2D 및 3D 배양 모두 문제이지만, 평면에서 존재하는 세포의 구조가 한층 더 차원에서 더 큰 효과를 갖는다. 이것은 세포막 EPAC1 프로브 PM-ICUE 같은 세포 구조에 지역화 프로브에 대한 큰 관심이다. Spiering 등의 알을 참조하십시오. 2,013에 대한 제안 비율 계산 (24)에 세포 두께 효과를 수정합니다. AEM의 분포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다프로브 조정 셀 및 이미징면의 지역에서 축적 경우 감지합니다. 이것은 또한, FRET 비의 공간 분포를 해석하는 스퓨리어스 결과를 제거하는 데 도움이 될 것 등., (낮은 AEM 영역이 낮은 프로브 농도가되며, 프로브 포화 높은 FRET 비를 나타낼 수있다 IE) 프로브 채도를 식별. 셋째, 다른 FRET 기준선 수준은, 형질 감염 효율의 차이를 나타내는 실험군 사이 발현 또는 기저 시그널링을 조사 할 수있다. "상대 분석"(단계 10.1.1)가 존재하는 경우 시간이 지남에 따라 FRET 비율 드리프트를 제거하는 데 도움이됩니다. 이 샘플 사이의 반응의 상대적인 크기의 비교를 용이하게하지만, 기준 샘플에 대한 응답 (제어 플롯 평면 라인)의 타임 코스에 비해을 방해. "절대 분석"(단계 10.1.2) 샘플 전체 응답 속도의 비교를 용이하게하지만, 각 라인은 dissim 의해 스케일링 때문에 반응의 크기를 비교하여 방해ILAR 정수입니다. 연구는 종종 시간이 지남에 따라 FRET 비율의 편차를 보정하는 기준에 선형 회귀 분석을 사용한다.
설명 된 3D FRET 방법은 제조 및 다른 프로브와 영상 방식에 적용 할 수있는 3 차원 셀 라덴 하이드로 겔의 경과 이미징을 수행하기에 유용하고 실용적인 방법이다. 전술 한 바와 같은 단일 쇄 이진 프로브 이외에 다른 FRET 시스템은 강도 계 신호의 더 복잡한 보정이 필요하다. 선택적으로, FRET (FLIM-FRET)의 형광 수명 이미징 프로브 도너의 발광 수명의 변화를 통해 FRET 효율을 계산하기 위해 사용될 수있다. 강도 기반의 FRET는 달리, FLIM-FRET은 배경 잡음 스펙트럼 블리드를 통해, 양자 효율 및 검출기 분광 감도 2에 민감하다. 그러나, FLIM 시스템은 고가의 복잡한, 그리고 드문 일이며, 하나의 지수 부패와 형광없이 FLIM 49 실행 – 오프에서 가장 잘 작동합니다. 설명 된 방법은 MO와 함께 사용될 수있다고급 현미경 플랫폼 재 (예., FRET-TIRF, 형광 이방성 및 스펙트럼 상관 FRET). 고속 공 초점 및 다 광자 현미경으로 3 차원 영상이 방법을 적용하는 시그널링 응답 서브 세포 분포의 분석을 용이하게 분석 신호의 정확성을 증가시킬 것이다. 이 3D FRET 방법은 시뮬레이션 3D 세포 미세 환경에서 고급 세포 생물학 연구를 가능하게 할 것이다. 이와 같이, 용이 약리학 및 세포 간 신호 전달 연구 및 설계 하이드로 기반 microtissues 약물 반응을 포함한 선별 재생 의료 요구에 적용 할 수있다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 피츠버그, 건강 상 K01 AR062598의 국립 연구소 및 보조금 P30의 DE030740 대학의 치과 의학의 학교의 재정 지원을 인정합니다. 저자는 ImageJ에 매크로 ImageJ에 마이클 대화방을 개발하기위한 ICUE1 플라스미드 박사 진 장, 웨인 Rasband 감사합니다.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] | Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) | NC0162601 | Reagents |
| Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) | Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich | 95904 | Reagents |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514 | Reagents |
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 440167 | Reagents |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470-5g | Reagents |
| 2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride | Fisher Scientific | AC244280100 | Reagents |
| 2-Butanone | Fisher Scientific | AC149670010 | Reagents |
| Lithium Bromide | Fisher Scientific | AC199871000 | Reagents |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 190764 | Reagents |
| Sigmacote (siliconizing reagent) | Sigma Aldrich | SL2 | Reagents |
| Toluene | Fisher Scientific | AC36441-0010 | Reagents |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH3025601 | Reagents |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) | Life Technologies | 11058-021 | Reagents |
| FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) | Promega | E2311 | Reagents |
| Cellstripper (cell dissociation solution) | Corning | 25-056-CI | Reagents |
| Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free | Corning | 356231 | Reagents |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Reagents |
| Pipette Tips (10,200,1000 μl) | Fisher Scientific | 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 | Disposable lab equipment |
| Powder Free Examination Gloves | Fisher Scientific | 19-149-863B | Disposable lab equipment |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Disposable lab equipment |
| Biopsy punch (3 mm) | Miltex | 3332 | Disposable lab equipment |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-544C | Disposable lab equipment |
| Precoated glass coverslips (epoxysilane) | Arrayit | CCSL | Disposable lab equipment |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12550D | Disposable lab equipment |
| Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) | Fisher Scientific | 14-959-70C, 14-959-49A | Disposable lab equipment |
| Cell culture dish (6-well) | Falcon | 351146 | Disposable lab equipment |
| Epifluorescent Microscope with motorized stage | Nikon | MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) | Large/non-disposable lab equipment |
| Adjustable Specimen Holder for XY Stage | Nikon | 77011393 | Non-disposable lab equipment |
| 60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) | Nikon | MRD01605 | Non-disposable lab equipment |
| CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) | Nikon (Sutter Instrument reseller) | 77016231, 77016088 | Non-disposable lab equipment |
| CYF/YFP filter set | Nikon (Chroma Technology Corp) | 77014928 | Non-disposable lab equipment |
| Camera (ORCA Flash 4.0 v1) | Nikon (Hamamatsu reseller) | 77054076 | Non-disposable lab-equipment |
| NIS-Elements 40.20.02 microscope software) | Nikon | MQS31100 | Non-disposable lab equipment |
| Prism (spreadsheet and graphing software) | GraphPad Software, Inc | Version 6 | Non-disposable lab equipment |
| OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) | OmniCure | S1000 | Large/non-disposable lab equipment |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | DP-100 | Non-disposable lab equipment |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | Reichert Bright-Line 1475 | Non-disposable lab equipment |
| Vacuum desiccator chamber/degasser | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Tissue Culture Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Chemical Fume Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Oven | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Spatula | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Beaker | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Incubator | Any | Large/non-disposable lab equipment |
References
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
- Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
- Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
- Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
- Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
- Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. . Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , (2014).
- Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
- Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O., Capri, A. . Progress in Molecular and Environmental Bioengineering – From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. , 117-149 (2011).
- Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
- Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
- Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
- Kikuchi, K., Nagamune, I. E. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. 119, 63-78 (2010).
- Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
- Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
- Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators – Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
- Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
- Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
- Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
- Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
- Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
- Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
- Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
- Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X., Burdick, J. A., Mauck, R. L. . Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. , 9-46 (2011).
- Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
- Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
- Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , (2014).
- Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
- Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
- Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).
