Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em> Pseudomonas aeruginosa</em

Not: Saflaştırılmış C-di-GMP raportör plasmidinin klonlama ve başkalaştırma için prosedürler başka 12 tartışılmıştır. C-di-GMP Muhabir P. Tagged GFP 1. Nesil aeruginosa'nın P. tek bir koloni ile lizojeni suyu 5 ml (LB) ortamı aşılamakta aeruginosa 200 rpm'de çalkalanarak bir gece boyunca 37 ° C inkübasyon ve. Transferi 2 1 L'lik bir şişe içinde, taze LB ortamında 200 ml, gece boyunca kültürün mi, 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin. 600 nm (OD 600), şişeden 1 ml numune alma ve (daha önce anlatıldığı gibi 12) bir spektrofotometre kullanılarak incelenmesi ile her 30 dakikada optik yoğunluk izleyin. OD 600 0.3 arasında ulaştığında – 0.5, 50 ml konik santrifüj tüpüne kültür 40 ml yerleştirin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8000 rpm'de santrifüj hücreleri topak süpernatantı ve r atınbuz soğukluğunda steril, 300 mM sukroz çözeltisi 40 ml hücreleri, e askıya. Aşama 1.5'te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi, 20 ml yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri bir kez Pelet. Aşama 1.5'te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi 400 ul içinde yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri son bir kez Pelet. Not: bu noktada hücre yoğunluğu mililitre başına yaklaşık olarak 1 x 10 11 koloni oluşturan birim (CFU / ml) olması gerekir. bunlar elektroporasyon hazır sonra, 30 dakika için, buz üzerinde hücreleri soğutun. P. 40 ul 0.2 ug / ul pCdrA :: GFP Cı plazmid 12 çözeltisi 1 ul ekle aeruginosa elektro-kompetan hücreler buz üzerinde önceden soğutulmuş olan bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde yukarıda hazırlanan. süspansiyon karıştırın ve önceden soğutulmuş 2 mm bir elektrot aralığı, elektroporasyon küvetine aktarılır. Not: pCdrA :: GFP </em> C: P. Cı-di-GMP hücre içi seviyesinin bir flüoresan değerini gösterir pUCP22Not-P cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp Gm r r, aeruginosa suşları, gelişmiş ve Rybtke ve ark., 12 ile doğrulandı. kağıt mendil ile küvetin dışına nem kaldırmak ve Elektroporatör örnek odası ve küvet. 2.5 kV, 25 | iF ve kapasitans ve 200 Ω direnç bir gerilim ile nabız. küvet çıkarın ve LB ortamı içinde 1 ml. Daha sonra, steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri transferi ve 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir. 10 ul, 50 ul (100 ug / ml'lik bir konsantrasyonda) ampisilin ile desteklenmiş steril LB-agar plakaları üzerine kültürün 100 ul alikotları yayılmış ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. (Excitati GFP ifade onaylamaktek bir koloni, standart bir GFP kanalı ile bir floresan mikroskobu altında plaka incelenmesi ve çekme ile 485 nm, 520 nm emisyon), 5 mi kilodan aşılanması için aşama 1.1 'de tarif edildiği gibi, gece boyunca inkübe edin. -80 ° C üst boru ve mağaza vida 2 ml 0.5 ml% 50 gliserol ile bir gece boyunca kültür 0.5 ml karıştırın. Aşılama için Starter Kültür 2. Hazırlık İki gün ekran önce, P. plaka aeruginosa'nın den (pCdrA :: GFP Cı plasmid ihtiva eden) -80 LB-agar plakası üzerine Cı stokunun ° yavaşça steril bir aşı kullanılarak plaka üzerinde bakteri yayarak (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş) döngü. 37 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır. Tarama akşam önce, P. tek bir koloni aşılamak LB ortamında 10 ml plakadan aeruginosa'dan tu (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş)olabilir ve 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de ön-kültür bir gece boyunca inkübe edilir. Ekranın gün, ayrıca bir OD% 5 LB ile seyreltilerek bir OD daha sonra 1.0 600 ve taze LB ortamı ilk seyreltilmesi ile bir gece boyunca ön kültür bir alt kültür hazırlanması 0.04 (01:25 oranında) 600 . Not: aşılanmış ortam toplam hacmi, test edilecek plakaların sayısına bağlıdır. % 5 LB gerekli konsantrasyona fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile% 100 LB seyreltilmesiyle yapılmıştır. Önemlisi, medya (% 5 LB) pCdrA kurucu aktivasyon :: P. GFP C veriyor aeruginosa. bunlar 384 gözlü levhalar içine tevzi edilmeden önce bakteri ortam alışmasına izin oda sıcaklığında 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde en az bir hızda kültür kabı içine steril bir manyetik karıştırıcı çubuğu ilave edin ve karıştırın. Ihtiva eden 384 çukurlu Plakalar 3. aşılama ve inkübasyonKüçük moleküller Not: Kısırlık ve iyi aseptik teknikler aşağıdaki adımlara büyük önem taşımaktadır. pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3'te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 20 ul tobramisin sülfat (25 mg / ml) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyular A23 içine pozitif kontrol kültürünün 40 ul – P23 (Şekil 2). negatif kontrol (% 0 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3'te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 30 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyu A24, negatif kontrol kültürün 40 ul – P24 (Şekil 2). P22 (Şekil 2) – küçük moleküller ile damgalanmış plakalarının her biri için, bir kuyu A1 (Kademe 2.3 anlatılan) ile seyreltildi, gece boyunca kültürün 40 ul hacmi inoküle. Not: Bu, bir sıvı tutucu rob kullanılarak elde edilebilirot. Bakteriyel kültürler heterojen özellikleri, dağıtma sırasında sürekli olarak ortam dağıtılan bakteri tutmak için sürekli ve orta ajitasyon sağlamak için önemlidir. Bunu yapmak için, manyetik dağıtım esnasında adım 2.4 acclimatized kültürü karıştırmaya devam edin. bir hava-geçirgen, örtücü bir conta ile plakaları Seal ve 37 ° C de 6 saat inkübe edilir. Not: hava geçirgen mühür 384 kuyuların arasında değişmeyen koşulları sağlamak ve plaka boyunca oksijen geçişlerini potansiyel gelişimini engelleyecek önemlidir. 4. Büyüme (OD 600) ve Hücre içi c-di-GMP Seviye Ölçümü (GFP) Yaklaşık 30 dakika spektrofotometrik ölçümden önce, yoğunlaşmayı önlemek için 37 ° C plaka okuyucu önceden ısıtmak. Yavaşça okumadan önce hava geçirgen kapak contası çıkarın. oyuk başına 10 yanıp ayarı ile 600 nm'lik bir dalga boyunda optik yoğunluk ölçme ve0,2 saniyelik bir yerleşme zamanı. Floresan ölçüm önce de A24 (negatif kontrol) dayalı bir otomatik kazanç ve odak ayarı yapmak ve% 75 (Şekil 2) kazanç hedef değerini ayarlayın. plaka okuyucu kontrol yazılımından, başlangıç ​​ölçümü tıklayın ve 'tıklayın' Odak ve Kazanç Ayarı / Plate kimlikleri '' sekmesine gidin. penceresinde sağ tarafta '' Odak Ayarı '' ve '' Kanal A '' seçeneğini seçin. '' Kazanç Ayarı 'seçip' 'iyi seçilmiş' ve 'Hedef değeri' 'olarak' '75' 'yazın. Son olarak, '' Ayarı Başlat 'tıklamadan önce plaka düzeni de A24 almak. Ayar yapılır sonra, '' Ölçümü başlatın 'üzerine tıklayın. kuyu ve bir settli başına 10 yanıp ayarı ile 485/520 nm uyarma / emisyon maxima GFP muhabir floresan ölçmek0.2 saniye ng süresi. incelenen tüm plakaları verileri toplayın. Not: Veri okumaları otomatik plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından varsayılan olarak kaydedilir. istatistiksel analiz paketini açmak için kontrol yazılımı içinde "Mars" ikonuna tıklayarak gör okumaları. analiz için verilere erişmek için ilgi plaka numarasına "çift tıklayarak" verileri almak. 5. Veri Analizi yüksek verimli ekranlar için en sık bildirilen kalite ölçütleri olan sağlam z 'analizi kullanılarak tahlil tekdüzelik ve tekrarlanabilirlik değerlendirin. Sağlam z 'formülü kullanarak hesaplayın: MAD (Medyan Mutlak Sapma) standart sapmasının tahmini olduğunda, p pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) ve n negatif kontrol hem OD 600 ve GFP v (% 0 inhibisyon) 'diredilen değerler. Not: ya da daha büyük 0.5'e eşit (her ikisi de OD 600 ve GFP ham veri için hesaplanan) sağlam bir Z 'değeri bir yöntemi mükemmel tahlil olarak kabul edilir. formül kullanılarak büyüme% 'sinin hesaplanması: Nerede Xi OD600 Her numunenin tekrarlanan OD 600 değeri iyidir. İnhibisyon% 'si OD600> 0, büyüme inhibitörü; % Önleme OD600 <0, büyütme faktörü. formül kullanılarak C-di-GMP hücre içi seviyesinin% inhibisyonunu değerlendirmek (keyfi floresan yoğunluğu birimleri değişim hücre yoğunluğundaki değişikliğin düzeltilmesi) Nerede Xi GFP Her numunenin tekrarlanan GFP değeri iyidir. İnhibisyon% 'si, GFP> 0, c-di-GMP inhibitörü; %# 160; İnhibisyon GFP <0, c-di-GMP destekleyicisi. örnekten hesaplanan medyan (ortanca ± 3 MAD), 3 MAD de isabet tespiti için eşik değeri de veri noktaları normal dağılıma varsayarak, her plaka-çıkışları okuyun. Not: Ancak gerekirse ±% 50 inhibisyon kesme daha tekrarlanabilir ve hassas doz tepki deneyleri için seçilebilir.