koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em> Xenopus laevis</em
Summary
Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
Abstract
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Introduction
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus koku alma ampul Kurbağa yavrularını laevis, burada sunulan yöntemler kayıt sıcaklık işleme hedefliyoruz. İlk protokol lekeleri ve koku alma ampul ikinci dereceden nöronlar ve koku alma sistemi esas bozulmadan kalır hangi bir örnek hazırlık sağlar. Böylece, sıcaklığa duyarlı γ-glomerulus aktivasyonu izlenir ve kemo-duyarlı bir komşu glomerül ile karşılaştırılabilir. Bu glomerulus benzersiz ikili innervasyonu spektral farklı boyalarla hücre elektroporasyon ile görüntülenmiştir. Ayrıca, büyük hap yükleme koku ampul içinde büyük miktarda kapsayan mitral hücre boyama sağlar. nöronal ağ işleme sıcaklığı kaynaklı sinyaller tekrarlanan uyaran uygulamaları ile kalsiyum ölçümleri alarak ve daha sonra etkinlik korelasyon görüntüleme verileri analiz edilerek ortaya çıkar.
protokol iki sofistike boyama proce vurgulamaktadır tatmin edici ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için dikkatli manipülasyon ve uygulama gerektiren her ikisi de DURES. elektroporasyon sırasında hayvanların herhangi bir yaralanma burun içine elektrotlar konumlandırma, özellikle kaçınılması gereken olmuştur. Optimal, koku epiteli ile hiçbir temas meydana gelmelidir. hayvanlar hala elektroporasyon işlemden sonra yaşayan ve iyileşme süresi dikkate alınması gerektiğini unutmayın. boyama kullanılan boyaların tiplerine bağlı olarak ortaya çıkabilir elektroporasyon bir tur, sonra çok zayıf kalırsa, onun yoğunluğu burun boya konsantrasyonu artırarak artırılabilir. Dekstran çiftli moleküller ve pasif difüzyon (1-2 mm / gün 10 hızında) yavaş aksonal taşıma gibi çeşitli mekanizmalar üzerinden taşınan olduğundan, başka bir alternatif hayvanlar kurban edilmeden önce elektroporasyon sonra 48 saat beklemek. Seçenek olarak ise, elektroporasyon iyileşme bir gün sonra tekrar edilebilir.
jove_content "> Bolus yükleme konfokal floresan mikroskop altında prosedürü izleme. mitral hücrelerin giren düzenleyen zordur ve uygulama pipet boyutu ve konumu gibi çeşitli parametrelere bağlıdır boya miktarı beri kritik bir adımdır için yararlı olduğunu kanıtlıyor boya uygulama süresini ayarlayarak ve bu şekilde preparasyonlar arasında benzer boyama sonuçları üretilmesi. Ayrıca, daha önce elektroporasyona tadpoles. (γ-glomerul içeren) küçük bir kümenin konumunu belirleyerek boya uygulama için en iyi konumu belirlemek için gereken en ölçümler sırasında kritik adım numunenin hem shift ve ağartma kaçınmaktır. kayması özenle mikroskop altında Ringer akışını konumlandırarak önlenebilir. ilgi alanı beyazlatma sınırlamak için olduğu gibi, ölçüm süresi esas düşürülmelidir .Kalsiyum duyarlı boyalar ile bolus yükleme boyama sadece çok sağlarSınırlı kontrast sağlıklı hücreler genellikle böylece düşük kalsiyum düzeyleri ve o zamandan beri zayıf bazal floresan göstermektedir. etkinlik korelasyon görüntüleme uygulanarak benzer kalsiyum sinyalleri ile faaliyet ve golleri yapılara dayalı kontrast oluşturarak bu sınırlama circumvents. Bu alım sonrası analizi yöntemi kalsiyum faiz (referans iz) bir seçilen bölgenin sinyal ve 3D hacmi her pikselin arasındaki korelasyon katsayısı hesaplar. Bu nedenle, güçlü Elde edilen sonuçlar, referans iz olarak seçilen aktivite desen bağlıdır. Ana odak mitral hücre innervasyon desen görselleştirmek için ise, spontan nöronal aktivitenin türetilen bir referans sinyal tercih ve en iyi sonuçları üretecek en aktif mitral hücrelerin seçmektir. mitral hücrelerin kemo ya da ısı duyarlı ağlar ortaya için, yalnızca histidin veya soğuk Ringer birine yanıt içeren referans izi seçilmelidir. bütün bir glomerulus o seçimiher zaman iki farklı uyaranlara yanıt yapılar birbirinin üstüne yalan, özellikle açık bir referans iz sağlamayabilir ilgi bölge olarak r mitral hücre soma. Böyle bir durumda, ilgi bölgesi olarak glomerüllerden veya hücre vücudun daha küçük bir alanı seçmek için genellikle yararlı olur.
Son birkaç on yılda, elektroporasyon, tek veya birden çok hücre 11,12 leke için etkili bir yöntem olarak tarif edilmiştir. Burada özellikle olfaktör reseptör nöronların etiketlemek için kullanılır. Dekstran-konjuge moleküller en yüksek verimliliği vermek ve non-kalsiyum duyarlı boyalar için, seçim aralığı geniş olan ve tipik olarak floresan mikroskobu 13 kullanılan tam spektrumu kapsar. Ancak, başarılı bir olfaktör reseptör nöronların içine electroporated kalsiyum duyarlı boyalar kalsiyum yeşil dekstran sınırlı şu anda, ve Flu-4 dekstran hala eğer piyasada mevcut. Bunun yanı sıra, kayıtlar esas superficia hedefSadece koku ampul ventral yüzeyinde l katmanları, hızlı ölçüm teknikleri penetrasyon derinliği sınırlı olduğundan. İki foton görüntüleme kısmen bu sınırlamanın üstesinden ancak genellikle hız yoksun ve daha fazla seçilebilir kalsiyum duyarlı boyalar miktarını kısıtlar olabilir.
Bu koku ampul ısı kaynaklı aktivitesini ölçmek için bir protokol tarif. Beyin neuropil sıcaklık koku işleme katılan kompleks hücresel ağlar görselleştirmek için üç boyutlu bir hacim olarak taranır. Koku ampul sıcaklık kaynaklı etkinliğinin ölçülmesi çok yakın 5 bildirilen ve farklı teknikleri birleştirerek bir özel özelleştirilmiş prosedürü gerektirir olmuştur. Yukarıda belirtilen tekniklerin büyük bir aktif hücrelerin yüz koku sisteminin en bozulmadan kalan bir hazırlık üç boyutlu olarak görüntülenmiş olmasıdır. Bu avantajlar beyin p yanı sıra boyama teknikleri yüksek talepleri koymakonarım ve görüntüleme. Örneğin, hücre elektroporasyon ve bolus yükleme koku epiteli ve ampul hücrelerin büyük miktarlarda vurmak ve böylece tam hücresel ağlar görselleştirme sağlar. Ayrıca, yerine genetik olarak kodlanmış fluorophores bolus yükleme yoluyla kimyasal göstergeler teslim türlerinin potansiyel büyük set ölçümleri sağlar. AM boyalarla banyo inkübasyon gibi diğer alternatifler öncelikle sağlam doku sadece birkaç yüz mikrometre bırakarak, ciddi koku ampul zarar dilimler halinde çalışır. γ-glomerül ikili innervasyon bozulmadan kalır ve kayıtları böylece hala ameliyat sistemde alınır karşılaştırıldığında, bizim protokolde kullanılan tüm montaj hazırlık örneğin sağlar. Son olarak, görüntüleme kendisi 3D hacimleri edinimi sağlayan hat-aydınlatma mikroskobu ile yapılır. Line-aydınlatma mikroskobu mümkün olan en yüksek alım hızları 6 sağlayan konfokal tekniklerden biridir </ Sup> gerekli olan koku ampul büyük bir kısmını kapsayacak. Yavaş toplama sistemleri kullanılabilir, ancak kaydedilen hacminin büyüklüğü azaltılması gerekmektedir dezavantaja sahiptir olabilir. Son yıllarda, hızlı görüntü elde etmek için diğer yöntemler geliştirilmiştir ve alternatif 14,15 olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, hat-aydınlatma mikroskobu yeterli hız ve çözünürlük hem de kazanmak için en kolay yöntemlerden biridir. Burada uygun görüntüleme kurulumları seçiminde yol gösterici olarak bazı bilgiler izler. kalsiyum görüntüleme kalın beyin hazırlıkları içinde yapılır yana, kurulum iyi confocality vermelidir ve hedefler 1.0 veya daha yüksek sayısal deliklere sahip olmalıdır. bir referans noktası, satır aydınlatma mikroskop ile çekilen kayıtlar 0.5-1 havadar birimlerinin iğne deliği boyutu ile standart bir lazer tarama mikroskobu ile çekilen görüntülere karşılık gelir. Hızlı kazanım hızı arzu edilir. 20 um kalınlığında bir birim, en az 5 L kapsadığıAyers, 100 um x 100 um bakış bir yanal alanı ve 0.5 um veya daha küçük bir piksel boyutu yığın başına 1 Hz, minimum hızda taranmalıdır. confocality azaltılması sayılan fotonların miktarını artırmak ve gerekirse böylece daha hızlı satın almalar için izin verir, ama daha out-of-odak ışığını kayıt dezavantajı vardır yapabilirsiniz. Bu tür bir yaklaşım, optik dilimlerin kalınlığı artırdığından, ancak, aslında ACI 6 uygulanmasından sonra farklı Z-düzlemleri boyunca dendritler izleme kolaylaştırabilir.
gerekli araçları yoğun burada sunulmaktadır koku alma ampul ağlarında sıcaklık işleme incelemek için. Sıcaklık kaynaklı etkinlik kalsiyum duyarlı boyalar ve sinyallerin ulaşan ve γ-glomerulus ayrılmaksızın her ikisi ile, birinci ve ikinci dereceden nöronlarda kaydedilir. Bundan başka, ne ölçüde bağımsız mitral hücrelerinin her iki kimya ve sıcaklık bilgisi değerlendirilebilir işlem. Hazırlık lea yanakoku alma ampul sağlam ves, koku işleme bilateral innervasyon rolü daha ele alınabilir. Işlem aynı zamanda koku ağları 5 örtüşen kodlanmış nasıl termo ve chemoinformation olsun ve ifşa için yararlıdır. Son olarak, yukarıda belirtilen teknikler koku ampul ısı tepkilerinin çalışma ile sınırlı değildir, ancak koku alma sisteminin bir genel değerlendirme büyük üç boyutlu bir hacim, özellikle hücresel işleme ağları için de uygulanabilir. Bolus yükleme ve aktivite korelasyon görüntüleme farklı beyin ağları 16 onları uygulanabilir hale gözlemlemek ve nöronların onlarca aktivitesini karşılaştırmak için güçlü araçlardır.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -. C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
