Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
De metoder som presenteras här syftar till inspelningsbearbetningstemperaturen i luktbulben av Xenopus laevis grodyngel. Protokollet fläckar första och andra ordningens neuron i luktbulben och ger en provberedning i vilken luktsystemet förblir i huvudsak intakt. Således kan aktivering av temperaturkänsliga γ-glomeruli övervakas och jämföras med cellgifter känsliga grann glomeruli. Den unika bilateral innervation av denna glomeruli visualiseras genom cell elektroporering med spektralt olika färgämnen. Dessutom möjliggör bolus lastning för färgning av mitralceller spänner en stor volym inom luktbulben. De neuronala nätverk bearbetning temperatur inducerade signaler avslöjas genom att kalcium mätningar med upprepade stimulans applikationer och därefter analysera data med aktivitetskorrelations avbildning.
Protokollet belyser två sofistikerade färgning proce anden, vilka båda kräver försiktig manipulation och praxis för att uppnå tillfredsställande och reproducerbara resultat. Under elektroporering någon skada av djuren måste undvikas, särskilt när placering av elektroderna i näsborrarna. Optimalt bör ingen kontakt med luktepitel inträffa. Observera att de djur som fortfarande lever efter elektroporering förfarandet och deras återhämtning tid måste tas i beaktande. Om färgningen fortfarande är alltför dåligt efter en runda av elektroporering, vilket kan hända beroende på de typer av färgämnen som används, kan dess intensitet ökas genom att öka färgämneskoncentrationen i näsborrarna. Eftersom dextran kopplade molekyler transporteras via flera mekanismer, inklusive långsam axonal transport (vid en hastighet av 1-2 mm / dag 10) och passiv diffusion, är ett annat alternativ att vänta 48 timmar efter elektroporering innan offra djuren. Alternativt kan elektroporering upprepas efter en dag av återhämtning.
jove_content "> Bolus lastning är ett kritiskt steg, eftersom mängden färgämne kommer in i mitralceller är svår att reglera och beror på olika parametrar såsom pipettspetsen storlek och platsen för programmet. Övervakning proceduren under ett konfokalt fluorescensmikroskop visar sig vara användbara för justera varaktigheten av färgämne tillämpning och därigenom generera liknande färgningsresultat över preparat. Dessutom tidigare electroporated grodyngel bör användas för att bestämma den bästa positionen för färgen ansökan genom att identifiera läget för litet kluster (innefattande γ-glomerulus). den mest kritiskt steg under mätningarna är att undvika både förskjutning och blekning av provet. Förskjutningen kan undvikas genom att omsorgsfullt positionera Ringer flöde under mikroskop. som för att begränsa blekning av området av intresse, bör mättiden reduceras till det väsentliga .Bolus lastning färgning med kalciumkänsliga färgämnen ger endast mycketbegränsad kontrast eftersom friska celler i allmänhet har låga kalciumnivåer och därmed svagt basal fluorescens. Tillämpa aktivitet korrelations avbildning kringgår denna begränsning genom att generera kontrast baserat på aktivitet och belyser strukturer med liknande kalciumsignaler. Detta efter förvärvet analysmetod beräknar korrelationsfaktor mellan kalciumsignalen av ett utvalt område av intresse (referens spår) och att varje enskild pixel i 3D-volymen. Därför är de erhållna resultaten starkt beroende av aktiviteten mönster valt som referens trace. Om huvudfokus är att visualisera mitral cell innervation mönster är en referenssignal härledd från spontan neuronal aktivitet föredras, och välja de mest aktiva mitralceller ger de bästa resultaten. För att avslöja de kemo- eller värmekänsliga nätverk av mitralceller bör referens spår bara innehåller svar på antingen histidin eller kall Ringers väljas. Valet av en hel glomerulus or mitral cell soma som region av intresse kan inte alltid ge en tydlig hänvisning spår, i synnerhet om de strukturer som svarar mot de två olika stimuli som ligger ovanpå varandra. I ett sådant fall är det ofta bra att välja ett mindre område av glomerulus eller cellkroppen som regionen av intresse.
Under de senaste decennierna har elektroporation beskrivits som en effektiv metod för att färga enstaka eller flera celler 11,12. Här används för att specifikt märka luktreceptor nervceller. Dextran-konjugerade molekyler ger den högsta effektiviteten, och för icke-kalciumkänsliga färgämnen, är området för val brett och täcker hela spektrat som typiskt används i fluorescensmikroskopi 13. Men kalciumkänsliga färgämnen som framgångsrikt electroporated i luktreceptor nervceller är för närvarande begränsad till kalcium-grön dextran och Fluo-4 dextran om det fortfarande kommersiellt tillgängliga. Dessutom inspelningar riktar främst superficial skikt på den ventrala ytan av endast luktloben, eftersom penetrationsdjupet av snabba mättekniker är begränsad. Två-foton avbildning kan delvis övervinna denna begränsning men ofta saknar hastighet och begränsar mängden valbara kalciumkänsliga färgämnen ytterligare.
Vi här beskrivit ett protokoll för mätning av temperatur-inducerad aktivitet i luktloben. Hjärnan neuropil skannas som en tredimensionell volym för att visualisera komplexa cellulära nätverk som deltar i lukt bearbetning av temperaturen. Mätning av temperatur-inducerad aktivitet i luktloben har nyligen rapporterats 5 och kräver ett specifikt anpassad förfarande som kombinerar olika tekniker. En stor tillgång av de tekniker som presenteras ovan är att hundratals celler avbildas i tre dimensioner i en beredning där det mesta av det olfaktoriska systemet förblir intakt. Dessa fördelar ställer höga krav på färgningsteknik samt hjärnan preparation och bildbehandling. Till exempel, cell elektroporation och bolus lastning drabbade stora mängder av celler i den olfaktoriska epitelet och glödlampa, och på så sätt göra det möjligt för visualisering av kompletta cellulära nätverk. Dessutom möjliggör leverans av kemiska indikatorer via bolus lastning i stället för genetiskt kodade fluoroforer mätningar i en potentiellt större uppsättning av arter. Andra alternativ som bad inkubation med AM färgämnen arbetar främst i skivor som skadar luktbulben allvarligt, vilket innebär att endast några hundra mikrometer av intakt vävnad. I jämförelse, hela berget preparat som används i våra protokoll säkerställer till exempel att det bilaterala innervation av γ-glomerulus förblir intakt och inspelningarna således tas i ett fortfarande operativsystemet. Slutligen är avbildning i sig gjort av linje-belysnings mikroskopi tillåter förvärvet av 3D-volymer. Line-belysning mikroskopi är en av de konfokala tekniker ger högsta möjliga förvärvspriser 6 </ Sup> som är nödvändiga för att täcka en stor del av luktbulben. Långsammare förvärvssystem kan användas, men har nackdelen att storleken på den inspelade volymen måste minskas. Under de senaste åren har andra metoder för snabb bildtagning utvecklats och kan användas som alternativ 14,15. Ändå förblir linje belysning mikroskopi ett av de enklaste metoderna för att vinna både tillräcklig hastighet och upplösning. Här följer lite information som riktlinjer för val av lämpliga avbildnings inställningar. Eftersom kalcium avbildning sker inom från tjocka hjärnpreparat, bör installationen erbjuda anständiga konfokalitet och målen bör ha bländare på 1,0 eller högre. För en referenspunkt, inspelningar som tagits med linjebelysnings mikroskop motsvarar bilder tagna med en vanlig laserskanning mikroskop med en pinhole storlek på 0,5-1 luftiga enheter. Snabb upptagningshastighet är önskvärd. En volym med en tjocklek av 20 ^ m omfattas av minst 5 layers, en lateral synfält om 100 ^ m x 100 ^ m och en pixelstorlek på 0,5 um eller mindre bör scannas vid en hastighet på minst 1 Hz per stack. Att minska konfokalitet kan öka mängden fotoner räknade och därmed möjliggör snabbare förvärv om det behövs, men har nackdelen att spela in mer out-of-fokus ljus. Eftersom ett sådant tillvägagångssätt ökar tjockleken på de optiska skivor, det kan faktiskt underlätta spårning av dendriter genom olika z-plan efter applicering av ACI 6.
De nödvändiga verktygen för att i stor utsträckning studera bearbetningstemperatur i luktloben nätverk presenteras häri. Temperatur inducerad aktivitet registreras i de första och andra ordningens neuron via kalciumkänsliga färgämnen och signaler både ankommande och avgående från γ-glomerulus. Vidare i vilken utsträckning enskilda mitralceller bearbeta både kemiska och temperaturinformation kan bedömas. Eftersom preparatet leaVes luktbulben intakt, kan ytterligare studeras roll bilaterala innervation i lukt bearbetning. Förfarandet är också användbart för att avslöja om och hur termo- och chemoinformation kodas i överlappande lukt nät 5. Slutligen tekniker som nämns ovan inte begränsad till studiet av temperatursvar i luktbulben men kan användas för en mer allmän utvärdering av luktsystemet, särskilt de cellulära bearbetningsnätverk i stora tredimensionella volymer. Bolus lastning och aktivitetskorrelations avbildning är kraftfulla verktyg för att följa och jämföra aktiviteten av dussintals nervceller, vilket gör dem som gäller för olika hjärnnätverk 16.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Reagents | |||
Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
Funnel applicator | (Custom-made) | ||
Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |