Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
Los métodos presentados en este documento tienen por objeto el procesamiento de registro de la temperatura en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis renacuajos. Las manchas de protocolo primeras y las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio y proporciona una preparación de la muestra en la que el sistema olfativo sigue siendo fundamentalmente intacta. Por lo tanto, la activación de la γ-glomérulo sensible a la temperatura se puede controlar y se compara con sus vecinos glomérulos quimio-sensible. La inervación bilateral única de este glomérulo se visualiza mediante la electroporación de células con espectralmente diferentes colorantes. Además, la carga de bolo permite la tinción de las células mitrales que abarcan un gran volumen dentro del bulbo olfatorio. Las señales inducidas por la temperatura de procesamiento de la red neuronal se revela mediante la adopción de medidas de estímulo de calcio con aplicaciones repetidas y, posteriormente, el análisis de los datos de imagen con la actividad de correlación.
El protocolo se destacan dos sofisticada proce tinción mientos, los cuales requieren la manipulación y la práctica prudente con el fin de lograr resultados satisfactorios y reproducibles. Durante la electroporación cualquier lesión de los animales se tiene que evitar, sobre todo cuando la colocación de los electrodos en las fosas nasales. De manera óptima, debe producirse ningún contacto con el epitelio olfativo. Tenga en cuenta que los animales siguen viviendo después del procedimiento de electroporación y su tiempo de recuperación deben tenerse en cuenta. Si la tinción sigue siendo demasiado débil después de una ronda de electroporación, que puede suceder dependiendo de los tipos de tintes utilizados, su intensidad puede ser mejorada mediante el aumento de la concentración de colorante en las fosas nasales. Dado que las moléculas de dextrano acoplado se transportan a través de varios mecanismos, incluyendo el transporte axonal lenta (a una velocidad de 1 a 2 mm / día 10) y difusión pasiva, otra alternativa es esperar 48 horas después de la electroporación antes de sacrificar los animales. Alternativamente, la electroporación se puede repetir después de un día de recuperación.
jove_content "> carga bolo es un paso crítico ya que la cantidad de colorante entrar en las células mitrales es difícil de regular y depende de varios parámetros como el tamaño de la punta de la pipeta y la ubicación de la aplicación. Seguimiento del procedimiento bajo un microscopio de fluorescencia confocal demuestra ser útil para el ajuste de la duración de la aplicación de colorante y por lo tanto la generación de resultados de tinción similares a través de las preparaciones. Además, renacuajos previamente electroporadas se deben utilizar para determinar la mejor posición para la aplicación de colorante mediante la identificación de la posición del pequeño grupo (que comprende la γ-glomérulo). la mayoría paso crítico durante las mediciones es evitar tanto cambio y el blanqueo de la muestra. el cambio se puede evitar colocando cuidadosamente el flujo de dos colores en el microscopio. en cuanto a limitar el blanqueo de la zona de interés, el tiempo de medición se debe reducir a lo esencial .Bolus tinción de carga con colorantes sensibles al calcio sólo proporciona muycontraste limitado, ya que las células sanas generalmente tienen niveles bajos de calcio y por lo tanto muestran la fluorescencia basal débil. La aplicación de imágenes de actividad correlación elude esta limitación mediante la generación de contraste basado en estructuras de actividad y se destacan con señales de calcio similares. Este método de análisis post-adquisición calcula el factor de correlación entre la señal de calcio de una región seleccionada de interés (traza de referencia) y la de cada pixel individual en el volumen 3D. Por lo tanto, los resultados obtenidos dependen fuertemente el patrón de actividad seleccionado como traza de referencia. Si el principal objetivo es visualizar los patrones de inervación de células mitrales, se prefiere una señal de referencia derivada de la actividad neuronal espontánea, y la elección de las células mitrales más activos producirá los mejores resultados. Para revelar las redes de quimio o termo-sensibles de las células mitrales, rastros de referencia sólo contienen respuestas a cualquiera de histidina o Ringer frío deben ser seleccionados. La selección de un glomérulo toda or soma celular mitral como región de interés no siempre puede dar una traza de referencia clara, sobre todo si las estructuras que responden a los dos estímulos diferentes son acostado en uno encima del otro. En tal caso, a menudo es útil para seleccionar un área más pequeña del glomérulo o cuerpo de la célula como región de interés.
En las últimas décadas, la electroporación se ha descrito como un método eficaz para teñir las células individuales o múltiples 11,12. Aquí se utiliza para etiquetar específicamente neuronas receptoras olfativas. Moléculas de dextrano conjugado dan la más alta eficiencia, y para colorantes no sensibles al calcio, el rango de selección es amplio y abarca el espectro completo que se utiliza típicamente en microscopía de fluorescencia 13. Sin embargo, colorantes sensibles al calcio que están sometidas a electroporación con éxito en las neuronas receptoras olfativas son por el momento limitado a dextrano de calcio-verde, y Fluo-4 dextrano si todavía está disponible comercialmente. Además, las grabaciones se dirigen principalmente superficial capas en la superficie ventral de sólo el bulbo olfatorio, ya que la profundidad de penetración de las técnicas de medición rápido es limitada. de dos fotones puede superar en parte esta limitación, pero a menudo carece de velocidad y restringe la cantidad de colorantes sensibles al calcio seleccionables más.
Hemos descrito aquí un protocolo para medir la actividad inducida por la temperatura en el bulbo olfatorio. El neurópila cerebro es escaneada como un volumen tridimensional para visualizar las complejas redes celulares implicados en el procesamiento olfativo de la temperatura. Medición de la actividad inducida por la temperatura en el bulbo olfativo se ha informado muy recientemente 5 y requiere un procedimiento adaptado específicamente la combinación de diferentes técnicas. Un activo importante de las técnicas presentadas anteriormente es que cientos de células se crean imágenes en tres dimensiones en una preparación en donde la mayor parte del sistema olfativo se mantiene intacta. Estas ventajas ponen altas exigencias en las técnicas de tinción, así como el cerebro pla reparación y la proyección de imagen. Por ejemplo, la electroporación de células y carga de bolo golpean grandes cantidades de células en el epitelio olfativo y bulbo, y por lo tanto permiten la visualización de las redes celulares completos. Por otra parte, la entrega de los indicadores químicos a través de la carga de bolo en lugar de fluoróforos genéticamente codificados permite realizar mediciones en un conjunto potencialmente mayor de especies. Otras alternativas como la incubación baño con tintes de AM trabajan principalmente en rodajas que dañan gravemente el bulbo olfatorio, dejando sólo unos pocos cientos de micrómetros de tejido intacto. En comparación, la preparación entera de montaje utilizado en nuestro protocolo asegura por ejemplo que la inervación bilateral de la γ-glomérulo permanece intacto y las grabaciones son entonces retirados en un sistema todavía operativa. Por último, la formación de imágenes en sí se realiza mediante microscopía de línea de iluminación que permite la adquisición de volúmenes 3D. Microscopía Line-iluminación es una de las técnicas confocales proporcionan las velocidades de adquisición de posibles más altos 6 </ Sup>, que son necesarios para cubrir una gran parte del bulbo olfatorio. sistemas de adquisición más lentos pueden ser usados pero tienen la desventaja de que el tamaño del volumen registrado debe ser reducida. En los últimos años, otros métodos para la adquisición rápida de imágenes se han desarrollado y se pueden utilizar como alternativas 14,15. Sin embargo, la microscopía de línea de iluminación sigue siendo uno de los métodos más fáciles para ganar velocidad y resolución suficiente. Aquí sigue una cierta información como guía para seleccionar las configuraciones de imagen adecuados. Desde imágenes de calcio se realiza dentro de las preparaciones de cerebro de espesor, la configuración debe proporcionar confocalidad decente y los objetivos debe tener aperturas numéricas de 1.0 o superior. Para un punto de referencia, las grabaciones tomadas con el microscopio línea de iluminación corresponden a las imágenes tomadas con un microscopio de barrido láser estándar con un tamaño del agujero de alfiler de 0,5-1 unidades ventiladas. la velocidad de adquisición rápida es deseable. Un volumen con un espesor de 20 micras cubierto por al menos 5 lAyers, un campo lateral de vista de 100 micras x 100 micras y un tamaño de píxel de 0,5 micras o menor debe ser escaneado a una velocidad mínima de 1 Hz por pila. La reducción de la confocalidad puede aumentar la cantidad de fotones contados y por lo tanto permite adquisiciones más rápidas si es necesario, pero tiene el inconveniente de grabación más luz fuera de foco. Sin embargo, ya que este enfoque aumenta el grosor de las rodajas ópticos, sino que puede facilitar la localización de dendritas a través de diferentes planos z después de la aplicación de ACI 6.
Las herramientas necesarias para estudiar ampliamente en las redes de procesamiento de temperatura del bulbo olfatorio se presentan en este documento. la actividad inducida por la temperatura se registra en el primer y segundo orden neuronas a través de los tintes y las señales de llegada o de salida de la γ-glomérulo sensibles al calcio. Además, el grado en que procesar las células mitrales individuales tanto información química y la temperatura se puede evaluar. Dado que la lea preparaciónves el bulbo olfatorio intacto, el papel de la inervación bilateral en el procesamiento olfativo puede ser estudiado más. El procedimiento también es útil para revelar si y cómo termopar y chemoinformation está codificado en la superposición de las redes olfativas 5. Por último, las técnicas mencionadas anteriormente no se limitan al estudio de las respuestas de temperatura en el bulbo olfatorio, pero se pueden aplicar para una evaluación más general del sistema olfativo, especialmente las redes de procesamiento celulares en grandes volúmenes tres dimensiones. Bolo de carga y de imagen actividad de correlación son herramientas poderosas para observar y comparar la actividad de las neuronas de decenas, por lo que es aplicable a diferentes redes cerebrales 16.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Reagents | |||
Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
Funnel applicator | (Custom-made) | ||
Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |