Запись температурное нейронную активность посредством мониторинга изменений кальция в обонятельной луковицы<em> Xenopus Laevis</em
Summary
Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
Abstract
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Introduction
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы , представленные здесь , направлены на температурной обработке записи в обонятельная луковица Xenopus Laevis головастиков. Протокола пятна первые и нейроны второго порядка в обонятельную луковицу и обеспечивает образец препарата, в котором обонятельная система остается в основном нетронутыми. Таким образом, активация чувствительного к температуре гамма-клубочек можно контролировать и по сравнению с его химио чувствительных соседних клубочков. Уникальный двусторонний иннервации этого клубочка визуализируется клеток электропорации с спектрально различных красителей. Кроме того, болюс нагрузка позволяет окрашивании митральных клеток, охватывающих большой объем в обонятельную луковицу. Нейронные сигналы температуры индуцированной обработки сети обнаруживается, проводя измерения кальция при повторных применений стимула и последующего анализа данных с активностью корреляционной обработки изображений.
Протокол выделяет два сложных окрашивания проце дур, оба из которых требуют осторожного манипулирования и практики с целью достижения удовлетворительных и воспроизводимых результатов. Во время электропорации любой травмы животных следует избегать, особенно при расположении электродов в ноздри. Оптимально, никакого контакта с обонятельный эпителий не должно происходить. Обратите внимание, что животные все еще живут после процедуры электропорации, и их время восстановления должны быть приняты во внимание. Если окрашивание остается слишком слабым, после того, как один раунд электропорации, который может произойти в зависимости от типов используемых красителей, его интенсивность может быть повышена за счет увеличения концентрации красителя в ноздри. Поскольку декстран связью молекулы транспортируются через несколько механизмов , в том числе и медленной аксонов транспорта (при скорости 1-2 мм / день 10) и пассивной диффузии, другая альтернатива должна ждать 48 часов после электропорации , прежде чем умерщвления животных. В качестве альтернативы, электропорация может повторяться после того, как один день восстановления.
jove_content "> Пилюли загрузки является важным шагом, так как количество красителя ввод митральных клеток трудно регулировать и зависит от различных параметров, таких как размер пипетку и расположение приложения. Контроль процедуры под конфокальной флуоресцентной микроскопии оказывается полезным для регулируя длительность применения красителя и, таким образом, генерируя аналогичные результаты окрашивания через препаратов. Кроме того, ранее электропорации головастиков следует использовать для определения оптимального положения применения красящей путем определения положения небольшого кластера (включающего гамма-клубочки). наиболее важным шагом в процессе измерений, чтобы избежать как сдвиг и отбелки образца. сдвиг можно избежать путем тщательного позиционирования потока Ringer под микроскопом. Как ограничить отбеливанию интересующей области, измерение времени должно быть сведено к существенным ,Пилюли нагрузка окрашивание кальция чувствительных красителей только обеспечивает оченьограниченный контраст, так как здоровые клетки, как правило, имеют низкий уровень кальция и, таким образом, показывают слабую базальной флуоресценции. Применяя деятельность корреляционной обработки изображений обходит это ограничение путем создания контраста на основе деятельности и выдвигает на первый план структур с аналогичными сигналами кальция. Этот метод анализа после приобретения вычисляет коэффициент корреляции между сигналом кальция выбранной области интереса (опорной трассы), и что каждого отдельного пикселя в 3D объеме. Таким образом, полученные результаты сильно зависят от характера активности, выбранной в качестве опорной трассы. Если основной акцент делается для визуализации митрального моделей клеток иннервации, опорный сигнал получен из спонтанной активности нейронов является предпочтительным, и выбор наиболее активных митральных клеток даст наилучшие результаты. Для выявления химио- или термочувствительным сети митральных клеток, опорные следы только содержащие ответы на любой из гистидина или холодной Ringer должны быть выбраны. Выбор целой клубочек OR митральный сомы клеток в области, представляющей интерес, может не всегда обеспечивают четкую опорной трассы, особенно если структуры, отвечающие на двух различных раздражителей, лежащих друг на друга. В таком случае, часто бывает полезно, чтобы выбрать меньшую площадь клубочек или тела клетки в качестве области, представляющей интерес.
В последние десятилетия, электропорации был описан как эффективный способ окрашивать одну или несколько ячеек 11,12. Здесь он используется для специально маркировать обонятельные нейроны рецептора. Декстран-конъюгированные молекулы дают самую высокую эффективность, а также для чувствительных красителей без кальция, диапазон выбора широк и охватывает полный спектр обычно используемый в флуоресцентной микроскопии 13. Тем не менее, кальций-чувствительные красители, которые успешно электропорации в обонятельные нейроны рецептора в настоящий момент ограничивается кальций-зеленый декстран, и Fluo-4 декстран, если до сих пор имеются в продаже. Кроме того, записи в первую очередь цель superficiaл слоев на вентральной поверхности только обонятельной луковицы, так как глубина проникновения быстрых методов измерений ограничено. визуализация Двухфотонного может частично преодолеть это ограничение, но часто не хватает скорости и ограничивает количество выбираемых кальция чувствительных красителей далее.
Мы описали здесь протокол для измерения температуры индуцированной активности в обонятельной луковице. Нейропиля мозг сканируется в качестве трехмерного объема для визуализации сложных сотовых сетей, участвующих в обонятельной обработке температуры. Измерение температуры индуцированной активности в обонятельной луковице было совсем недавно сообщили 5 и требует специально настроенную процедуру , комбинируя различные методы. Основным активом методов, представленных выше, является то, что сотни клеток изображаются в трех измерениях в препарате, где большая часть обонятельной системы остается неизменным. Эти преимущества предъявляет высокие требования к технике окрашивания, а также мозга рвозмещения ущерба и формирования изображения. Например, клетка электропорации и болюс нагрузка попадание больших количеств клеток в обонятельный эпителий и колбой, и, таким образом, позволяют визуализировать полных сотовых сетей. Кроме того, поставка химических показателей с помощью болюсной нагрузки вместо генетически кодируемых флуорофоров позволяет проводить измерения в потенциально больший набор видов. Другие альтернативы, как ванны инкубации с АМ красителей в основном работают в срезах, которые повреждают обонятельной луковицы сильно, оставляя лишь несколько сотен микрометров неповрежденной ткани. Для сравнения, вся подготовка монтирования используется в нашем протоколе гарантирует, например, что двусторонний иннервации гамма-клубочки остается неповрежденным и записи, таким образом, приняты в еще оперативной системе. Наконец, сама визуализация осуществляется с помощью линейного освещения микроскопии, позволяющей приобретение 3D томов. Line-подсветка микроскопии является одним из конфокальных методов , обеспечивающих самые высокие цены приобретения 6 </ SUP>, которые необходимы, чтобы покрыть большую часть обонятельной луковицы. Более медленные системы сбора данных могут быть использованы, но имеют тот недостаток, что размер записанного объема должен быть уменьшен. В последние годы, другие методы быстрого получения изображения были разработаны и могут быть использованы в качестве альтернативы 14,15. Тем не менее, линии освещения микроскопии остается одним из самых простых способов, чтобы получить и достаточную скорость и разрешение. Далее следует некоторую информацию в качестве руководства для выбора подходящих установок визуализации. Поскольку визуализация кальция производится в пределах от толстых препаратов мозга, установка должна обеспечивать достойную confocality и задачи должны иметь числовой апертуры 1,0 или выше. Для опорной точки, записи, сделанные с помощью линии освещения микроскопа соответствуют снимков, сделанных с помощью стандартного лазерного сканирующего микроскопа с точечным отверстием размером 0,5-1 воздушных единиц. Быстрая скорость сбора желательно. Объем с толщиной 20 мкм, покрыта, по меньшей мере, 5 лАйерс, боковое поле зрения мкм х 100 мкм 100 и размером пикселя 0,5 мкм или меньше, должны быть отсканированы при минимальной скорости 1 Гц на стек. Снижение confocality может увеличить количество фотонов, подсчитанных и, таким образом, позволяет быстрее приобретения в случае необходимости, но имеет недостаток, заключающийся в записи больше из фокуса свет. Тем не менее, так как такой подход увеличивает толщину оптических срезов, он может на самом деле содействия отслеживанию дендритов через различные Z-плоскостей после применения ACI 6.
Необходимые инструменты для изучения широко обработки температуры в обонятельных луковиц сети представлены в настоящем документе. Температурное активность регистрируется в первом и втором нейронами порядка с помощью кальций-чувствительных красителей и сигналов обоих прибывающих и вылетающих из гамма-клубочка. Кроме того, степень, в которой отдельные обрабатывать митральных клеток как химических, так и температуры информация может быть оценена. Поскольку препарат LEAVES обонятельной луковицы неповрежденной, роль двустороннего иннервации в обонятельной обработки может быть дополнительно изучена. Эта процедура также полезна для выявления ли и как термо- и chemoinformation кодируется в пересекающихся обонятельные сетей 5. И, наконец, методы, упомянутые выше, не ограничиваются изучением реакций температуры в обонятельную луковицу, но может быть применен и для более общей оценки обонятельной системы, особенно сотовых сетей, для обработки в больших трехмерных объемов. Пилюли нагрузки и активность корреляции изображений являются мощными инструментами для наблюдения и сравнить активность десятков нейронов, что делает их применимыми к различным сетям мозга 16.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -. C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
