Opptak Temperatur-indusert neuronal aktivitet gjennom Overvåking Kalsium endringer i luktelappen av<em> Xenopus laevis</em

Alle eksperimenter med Xenopus laevis rumpetroll ble utført i henhold til de retningslinjer godkjent av Göttingen universitet Committee of Ethics i forsøk med dyr. 1. Electroporation Velg dyr av stadier 49-54 ifølge Nieuwkoop og Faber 7. Sørge for at innspillingen oppsett består av et stereomikroskop med en stor arbeidsavstand og en elektroporering anordning som ved en frekvens på minst 2 Hz kan gjelde spenningspulser på 20 V til 20 ms. Anvende de spenningspulser via to platinaelektroder med en grov diameter på 200 mikrometer, slik at de kan settes inn i Tadpoles 'neseborene uten å forårsake skade. Fremstille krystaller av et dekstran konjugert fargestoff (f.eks, kalsium Grønn 10 kDa dekstran, eller Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) ved å oppløse det vanligvis levert mengde av 5 mg i omtrent 100 pl destillert vann og å la små dråper av2 pl tørre på et ark Parafilm. Merk: Krystallene tørkes i mindre enn en dag og lagres deretter ved -18 ° C i fryseren i en periode på over et år. Bedøve dyrene ved å plassere dem i springvann inneholdende 3% Tricaine metansulfonat i 1-2 min inntil den når kirurgisk anestesi tilstand karakterisert ved redusert hjertefrekvens, tap av alle bevegelser og mangel på respons på mekaniske stimuli. Dypp bedøvet dyret i 10 sek i rent vann fra springen. Plasser dyret på en gel pute og fikse det ved å plassere nåler rundt det uten å skade den. Merk: Ikke fest dyret ved poking nåler gjennom huden. tørk forsiktig området rundt neseborene med en vev. Plasser dyret under stereomikroskop og fokus på neseborene. Bruk pinsett til å plukke en farge krystall av størrelse matchende neseboret hull, legg den i en av nesehulene og vent til den er oppløst helt, wjør tar mindre enn 1 min. Dersom krystallene er mindre, legge til to eller tre inn i hvert hulrom inntil de frembringer en ikke-gjennomskinnelig høy-konsentrerte oppløsning. Plasser katoden på huden av rumpetroll og anoden i et av neseborene. Merk: Dette bestemte innstillingen gjelder for fargestoffer sitert i trinn 1.3. For fargestoffer med en annen polaritet, kan fargingsresultater forbedres ved å plassere katoden inn i neseborene. Hvis du er usikker om polariteten av fargestoff, kan begge elektrodene plasseres samtidig i neseborene (ett per nesebor), og polariteten vekslet mellom enkelt spenningspulser. Påfør seks pulser av 20 V og 20 ms med ca 0,5 sek på stimulus intervall. Merk: Små bobler skal vises rundt elektroden i neseboret i løpet av electroporation forutsatt at elektrodene er i kontakt med huden og løsningen i neseboret. Hvis ingen bobler er synlige kontrollere tilkoblingskabler og sørg for at electroporating distribusjonse leverer den ønskede spenningspuls. Gjenta prosedyren (01.09 til 01.11) for det andre neseboret. Overfør elektroporert rumpetroll inn i et begerglass fylt med vann fra springen ved romtemperatur. Vent 5 til 10 min før dyret gjenvinner bevissthet og gjenopptar sin svømming. Mate den og la den komme i minst en dag hvor fargestoffet transporteres langs luktenerven til luktelappen. Bruk electroporated dyr innenfor 1-7 dager etter electroporation for beste bilderesultatene. Gi minst 24 timers tid for fargestoff transport og gjenvinning før bildebehandling. 2. Hele Mount Forberedelse Bedøve dyret i vann fra springen inneholder 3% Tricaine metansulfonat til alle bevegelser har stoppet og det ikke lenger reagerer på mekanisk stimulering. Overfør rumpetroll til en gel pute under et stereomikroskop og fikse det tett ved poking nåler gjennom huden på hver side av forebrain. Ofre rumpetroll av severing sin ryggmargen. Bruk en skalpell til å dissekere ut en blokk av vev som inneholder både nesehulene, olfactory nerver og olfactory pærer (Figur 1a). Gjør det første snittet nær venstre nesebor, uten å berøre det-og flytte bladet fremover skjæring langs venstre luktenerven og pære til telencephalic-diencephalic grensen. Gjøre det samme på høyre side. Isoler forberedelse fra resten av nervesystemet ved å gjøre et siste kutt posterior til telencephalon. Kast kroppen av rumpetroll og snu forsiktig vevsblokk opp ned slik at ventral side av hjernen forberedelse vender oppover. Pin vevsblokk igjen ved å sette inn to nåler mellom olfactory nerver. Sette en dråpe av frosk Ringer-oppløsning (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glukose, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, regulert til pH 7,8, osmolakerhet på 230 mOsmol / L) på vevet. Fjern hjernehinnene som dekker axon sortering sonen og olfactory pærer ved å gjøre tre snitt bruker gode saks. Starter fra bakre kant av vevsblokk, kuttet caudorostrally tett langs venstre luktelappen før inngangen punktet olfactory nerver til pærene (axon sortering sone). Gjenta trinn 2.8 for den høyre hjernehalvdelen. Hev hjernehinnene med pinsett og gjøre den tredje kutt, vinkelrett på de forrige på aksonet sortering sonen. Merk: ventral side av luktelappen er nå tilgjengelig for bildebehandling og bolus lasting. For å forbedre bildekvaliteten i det overførte lys bilde, gjenta prosedyren for ryggsiden. Disse ekstra trinn kan forenkle navigeringen av mikropipette for bolus lasting, men er strengt tatt ikke nødvendig. Overføre prøven til et registreringskammer som er fylt med frosk Ringers for videre behandling og avbildning. Gjør ature at ventral side vender oppover og fest prøven med et nett av nylon fiber strakte seg over en liten platina ramme. For en lettere anvendelse av stimuli sted nesehulene på toppen av en av nylonfibre. 3. Bolus Loading Oppløs 50 ug av kalsium AM fargestoff (f.eks Fluo-8 AM) i 20 ul dimetylsulfoksid (DMSO) inneholdende 20% av Pluronic F-127 (w / v) for å fremstille en stamoppløsning av AM fargestoff. Fryse stamløsninger i små porsjoner av 1-2 ul volum. Aksjen løsningen er stabil i minst et halvt år, men unngå å fryse-tine sykluser. Bruk en mikropipette avtrekker og trekke pipetter med en motstand på 5-8 Megohm og et tips diameter på 1-2 mikrometer. Oppløs den fremstilte stamløsning av fargestoffet i frosken Ringers løsning med en konsentrasjon på 250-500 pM. Legg MK571 for å nå en konsentrasjon på 500 pM for å blokkere multiresistens transportører. Fyll mikropipette med 10 mL av løsningen ved hjelp av en langstrakt pipette tips og fjerne alle luftbobler ved å flikke mikropipette. Monter mikropipette i pipetten holderen og sørge for at trykket kan påføres enten manuelt med en sprøyte eller en pneumatisk narkotika utstøting enheten og overvåke påførte trykk med en måler. Hvis det er mulig, bruker et mikroskop oppsett med evne til å opphisse den injiserte fargestoff slik at utstrømningen fra mikropipette spissen kan visualiseres og justeres. Bruk helst en confocal bildebehandling oppsett. Bruk en oppreist mikroskop med en nedsenking objektiv slik at vevet kan nås med mikropipette. Plasser hele mount forberedelse under mikroskop, følger luktenerven til pære og fokusere på det området av interesse i luktelappen. Perfuse frisk Ringer-oppløsningen gjennom opptakskammeret for å øke levedyktigheten av preparatet og vaske ut fargestoffet lekkerfra mikropipette spissen. Senk pipette til overflaten av luktelappen, med spissen pekende inn i den rostrale retning av preparatet. Påfør en liten og konstant positivt trykk (~ 25 hPa) til mikropipette å forhindre tilstopping av pipette og sett det forsiktig inn i vevet. Når pipetten har brutt de ytre vev lag, flytte den i en rostro-dorsal retning inn i mitral celle laget. (Merk at en teller farging av olfactory reseptor nerveceller ved elektroporering er nyttig å justere mikropipette posisjon.) Ideelt plassere pipettespissen i en avstand på 50-100 mikrometer fra ønsket opptaks nettstedet. For farging av temperaturfølsomme γ-glomerulus, rettet mot et område omkring 50 um rostrally fra posisjonen av den presynaptiske neuropil av γ-glomerulus. Påføre et positivt trykk i området fra 100 til 200 hPa. Juster trykkfasthet, avhengig av størrelsenmikropipette spissen. Bekreft utstrømningen fra pipetten ved å se for små vev bevegelser synlig under Brightlight belysning når trykket er brukt for første gang. Opprettholde et konstant trykk i omtrent 10 min, mens mikropipette forblir i vevet. Hvis mulig, sjekk neuropil i mellomtiden for celle lasting under fluorescerende belysning som vellykket lasting vil resultere i synlig celle somata farging med økende intensitet over tid. Merk: Ofte er årsaken til mislykket lasting er pipette tilstopping på grunn av vev inn i tuppen eller aggregerte fargestoff klynger. Det er noen ganger mulig å redde pipette ved forsiktig å bryte sin spiss mot den nedre flate av opptakskammeret. Imidlertid bør pipettespissen ikke overstige noen få mikrometer. Kompensere større pipettes åpninger ved å bruke lavere trykk under bolus lasting. Etter 10 minutter før lasting, redusere det påførte trykket til null og kontrollere farging. Notat: Størrelsen på det fargede området varierer betydelig og avhenger av flere parametere som mengden av injisert fargestoff og plasseringen av utskytings området. En god farge dekker et område på omkring 100 pm x 100 pm. Hvis de fargede området er for lite eller ikke dekker den ønskede opptaks nettstedet, gjenta trinn 03.10 til 03.13. Bruk samme mikropipette for neste injeksjon hvis det ennå ikke har tettet. Vent minst 30 minutter etter siste injeksjon før du starter noen eksperimenter for å tillate fargestoff opptak og deforestrings. Fortsett å perfuse opptakskammeret med frisk Ringer-løsning til enhver tid. 4. Innstillinger Måle Kontroller at måleoppsettet består av en konfokalmikroskop med tilstrekkelig hastighet til å registrere tredimensjonale volumer. Velg et oppkjøp hastighet på minst 1 Hz per stack. Merk: Passende oppsett inkluderer for eksempel line-belysning mikroskoper skanning prøven line-messig i stedet for punkt ved point. En enkel realisering av et slikt oppsett er tidligere beskrevet seks. Andre alternativer er spinning disk mikroskoper. Dersom slik oppsettet er tilgjengelig, er det fortsatt mulig å måle mindre områder med en normal punkt-scanning oppsett. Setter måleparametrene slik at et volum stort nok til å passe størrelsen av en glomerulus kan dekkes. Merk: Den typiske tykkelsen av et opptaksvolumet er i området 20 mikrometer, som skal dekkes av minst 5 lag. Sjekk alle presynaptiske målinger for bleking. Juster laser makt til gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av innspilte bilder ikke synker over tid løpet av opptaket. Begrens måling tid og område for opptak på den postsynaptiske siden for å unngå bleking så mye som mulig, selv for målinger overstiger 20-30 sek bleking er sannsynlig. 5. Lukt Søknad og Temperatur Experiments hell 25ml frisk Ringer-løsning (tidligere lagret ved 4 ° C) i et 50 ml rør. Plasser røret i en isen bøtte. Overvåke temperaturen av den kjølte Ringer ved å sette den rene sonden av et termometer inn i røret. Vent til temperaturen synker under 1 ° C før start av eksperimentet. Fremstille 50 ml L-histidin oppløses i Ringer-oppløsning ved en konsentrasjon på 10 uM. Bruk en trakt applikator 8 eller lignende applikasjoner slik stimulans levering samtidig til perfusert Ringer slik at vannstrømmen i kammeret forblir konstant og uavbrutt under utgivelsen av stimulus løsning. Plasser trakten på en slik måte at den distale utløp er mindre enn 1 mm fra det olfaktoriske epitel. Plasser en NiCr-Ni temperaturføler som er koblet til et digitalt termometer nær epitelet og utløpet av trakten applikator. Wire termometeret utgang til en datamaskin for å spille inn og visuelt disspille spenningsendringer som gjenspeiler små temperatursvingninger. Før eksperimentet startes, koble en annen termosensor til en standard termometer for å etablere den spenning-til-temperaturskalafaktor. Kartlegge badetemperatur i opptaksrommet og sikre at den ikke overstiger 22 ° C. Start image oppkjøpet og sekvensielt gjelder 200-400 ul kald Ringer, L-histidin og romtemperatur Ringer (20-22 ° C) via en elektronisk pipette med en interstimulus intervall på 20-30 sek. For en bedre kontroll av stimulus søknaden, slipper stimulus med et triggersignal sendes av den valgte bildeoppsettet til pipetten hvis mulig. Gjenta påfør protokollen for reproduserbare resultater. Ta sett med lengre opptak med flere runder med stimulering siden de er å foretrekke for post-bildeanalyse med aktivitet korrelasjon bildebehandling. Merk: Et kompromiss mellom opptakstiden og sektoren levedyktighet harå bli funnet. Målinger av ca. 2 min dekker 6 stimulerings applikasjoner gir tilstrekkelig aktivitet for en god rekonstruksjon av nettverket. 6. Bildebehandling Bruke aktivitet korrelasjon Imaging (ACI) Bildebehandling av den presynaptiske Recordings I innspillinger med stimulering av kulde Ringer løsning og histidin, skille temperaturfølsom γ-neuropil fra nabo histidin sensitive glomerulus av sine ulike svarprofiler (se Kludt et al. 5). Skape en maksimal intensitet fremspring i aksial retning fra opptak i hjernen preparat hvor Orns har blitt elektroporert med to forskjellige fargestoffer for å visualisere den bilaterale innervasjon av γ-glomerulus. Bildebehandling av den postsynaptiske Recordings Bruke aktivitet korrelasjon Imaging (ACI) Velg innspillinger med tilstrekkelig tidspunkter (mer enn 100 rammer) og en anstendig mengde aktivitet (minst to hendelser). Merk: Aktiviteten kan enten være spontan å avdekke prosessene i enkelt mitral celler eller indusert av flere anvendelser av stimuli i samme opptak for å avsløre mobilnettverk aktiveres av olfactory stimuli. Velge registreringer hvor de målte strukturene beveger seg ikke mer enn 2-3 piksler i løpet av tidsforløpet av opptaket. Merk: Opptak med for mye bevegelse kan bli reddet ved å påføre et skifte korreksjon prosedyren beskrevet i Kludt et al fem. Sjekk om opptakene lider av bleking. Dersom den gjennomsnittlige intensitet av hele bildet synker i løpet av tidsforløpet av opptaket, er blekemiddel korreksjon er nødvendig, ellers hoppe over de neste to trinn. Beregn lineære trenden for tiden trase for hver piksel ved å utføre en lineær regresjon. Subtrahere resultatet fra hver piksel individuelt for å eliminere den lineære komponenter;t av bleke. Merk: Som et alternativ Legendre passende kan anvendes som beskrevet av Bao og Schild 9. Last ned klar til bruk MATLAB script sammen med en steg-for-steg guide for aktivitet korrelasjon imaging (ACI) som beskrevet av Junek et al. 6 Merk: Følg trinnene som er beskrevet i Junek et al 6 som et alternativ til å bruke den medfølgende MATLAB script.. Flytt filene 'aci.m', 'matVis.m' og 'aci_roiSelector.m' fra den nedlastede beholderen til MATLAB banen av systemet som brukes for dataanalyse. Laster rådata overtatte i trinn 5.8 som en variabel i MATLAB bruker arbeidsområde organisert som en [x, y, z, t] -matrix med x og y med henvisning til de laterale dimensjoner, z, aksial retning og t, tidsforløpet . Call "ACI" fra MATLAB kommandolinjen. I brukergrensesnittet (UI)som vises, velg "Forbered Data ', velg deretter variabel som inneholder data og en katalog der resultatene vil bli lagret. Merk: For en fullstendig beskrivelse av UI se manualen som følger med ACI script. Bla gjennom de målte z-lag ved å flytte den tilsvarende glidebryteren i brukergrensesnittet for å få en oversikt over variansen kartet vises. Angi størrelsen på regionen av interesse (ROI) i brukergrensesnittet. For en mitral celle soma justere ROI for å strekke seg over omtrent 10 mikrometer i den laterale og 5 um i den aksiale retning. For en glomerulus, er litt høyere verdier av 20 um i sideretningen og 10 mm aksialt er passende. Merk: ROI størrelse må legges inn som et antall piksler, som avhenger av pikselskalerings valgt for opptak. Velg en ROI som inneholder γ-glomerulus og flere regioner for hvert synlig soma av de omkringliggende mitral celler ved å klikke med midtre museknapp på center av cellen / glomerulus. Lukk hoved UI som utløser beregning av korrelasjon kart for alle referanse spor. Resultatet lagres automatisk og vises.