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Summary
Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
Abstract
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Introduction
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus의의 후각 망울이 올챙이를 laevis의에서 여기에 제시된 방법은 기록 온도 처리를 목표로하고 있습니다. 첫 번째 프로토콜 얼룩과 후각 망울에서 2 차 신경 세포와 후각 시스템이 주로 그대로 남아있는 샘플 준비를 제공합니다. 따라서, 온도에 민감한 γ-사구체의 작동을 모니터링 및 항암 성 사구체 이웃과 비교 될 수있다. 이 사구체의 독특한 양자 신경 분포는 스펙트럼 서로 다른 염료로 전지 전기에 의해 가시화된다. 또한, 일시로드는 후각 망울 내에서 많은 양의에 걸쳐 승모판 세포의 염색이 가능합니다. 신경 네트워크 처리 온도 – 유도 신호는 반복 자극 애플리케이션 칼슘 측정과 후속 활동 상관 촬상하여 데이터를 분석함으로써 드러난다.
이 프로토콜은 두 개의 정교한 염색 proce을 강조 만족하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 신중한 조작과 실제 필요할 둘 절차들. 일렉트로 동안 동물의 부상은 콧 구멍에 전극을 위치시키는, 특히 피해야한다. 최적, 후각 상피 세포와 접촉이 발생하지 않습니다. 동물이 여전히 전기 과정을 거친 후 살고과 복구 시간이 고려되어야합니다. 염색 사용한 색소의 종류에 따라 발생할 수있는 전기의 일주 후 너무 약한 남아 있으면, 그 강도는 콧 구멍에 염료 농도를 증가시킴으로써 향상 될 수있다. 덱스 트란 결합 분자 및 수동 확산 (1-2 월 / 10 일의 속도) 느린 축삭 수송 등 여러 가지 메커니즘을 통해 전송되기 때문에, 다른 대안은 동물을 희생하기 전에 전기 후 48 시간 기다려야하는 것입니다. 대안 적으로, 전기 복구 1 일 후 반복 될 수있다.
jove_content는 "> 루스 로딩 공 초점 형광 현미경 절차를 모니터링. 승모판 셀에 진입하면 규제 어렵고 애플리케이션의 피펫 팁의 크기 및 위치와 같은 다양한 파라미터에 의존 색소 량이 보낸 중요한 단계이다 유용한 것으로 입증 염색 프로그램의 지속 기간을 조정함으로써 제제 걸쳐 유사한 염색 결과를 발생시킨다. 또한, 이전에 전기 천공 올챙이는.합니다 (γ-사구체를 포함하는) 작은 클러스터의 위치를 식별하여 색소 애플리케이션에 대한 최적의 위치를 결정하는 데 사용되어야하는 가장 측정시 주요 단계는, 상기 샘플의 양 변화 및 탈색을 방지한다. 시프트 신중 현미경 링거 흐름을 위치시킴으로써 피할 수있다. 관심 영역의 표백을 제한하는 바와 같이, 측정 시간이 필수적으로 감소되어야 .칼슘에 민감한 염료와 일시 로딩 염색은 매우 제공제한된 반면 건강한 세포는 일반적으로 이렇게 낮은 칼슘 농도가 이후 기저 약한 형광을 나타낸다. 활동의 상관 관계 이미징을 적용하면 유사한 칼슘 신호와 활동과 주요 구조에 따라 명암을 생성하여이 제한을 우회. 이 포스트 수집 해석 방법은 칼슘이자 (기준 트레이스)의 선택된 영역의 신호와 상기 3 차원 볼륨 각 화소의 사이의 상관 계수를 계산한다. 따라서 강력 얻어진 결과는 기준 트레이스로서 선택된 활동 패턴에 의존한다. 주요 초점은 승모판 세포의 신경 분포 패턴을 시각화하는 경우 자발적 신경 활성로부터 유도 된 기준 신호가 바람직하고, 가장 좋은 결과를 얻을 가장 활성 승모판 셀을 선택한다. 승모판 세포의 화학 치료 또는 온도에 민감한 네트워크를 드러내는를 들어, 만 히스티딘 또는 차가운 벨소리 중 하나에 대한 응답을 포함하는 기준 흔적을 선택해야합니다. 전체 사구체 오의 선택항상 두 개의 서로 다른 자극에 응답하는 구조가 서로의 상단에 누워있다 특히, 명확한 기준 추적을 제공하지 않을 수도 있습니다 관심의 영역과 연구 승모판 세포 소마. 이러한 경우, 관심있는 영역으로서 사구체 또는 전지 본체의 작은 영역을 선택하는 것이 유용하다.
지난 수십 년 동안, 전기가 하나 또는 여러 개의 셀 (11, 12)를 착색 할 수있는 효율적인 방법으로 설명되었다. 여기는 특히 후각 수용체 뉴런 레이블을하는 데 사용됩니다. 덱스 트란 공액 분자는 높은 효율을 제공하고, 비 – 칼슘 민감성 염료, 선택의 폭이 넓다 통상적 형광 현미경 (13)에 사용되는 전체 스펙트럼을 커버한다. 그러나 성공적으로 후각 수용체 신경 세포에 전기 천공되어 칼슘에 민감한 염료는 칼슘 녹색 덱스 트란에 한정되는 순간에, 그리고 FLUO-4 덱스 트란 여전히 경우 시중에서 판매. 또한, 녹음은 주로 superficia을 대상으로단지 후각 망울의 복부 표면에 L 층 빠른 측정 기술의 침투 깊이를 제한하기 때문이다. 이광자 촬상 부분적 이러한 한계를 극복하지만 종종 속도 부족 및 상기 선택 칼슘 민감성 염료의 양을 제한 할 수있다.
우리는 후각 망울에서 온도에 의한 활성을 측정 여기 프로토콜을 설명했다. 뇌 neuropil는 온도의 후각 처리에 관련된 복잡한 셀룰러 네트워크를 시각화하는 세 가지 차원 볼륨으로 스캔됩니다. 후각 망울에서 온도에 의한 활성 측정은 아주 최근 5를보고 다른 기술을 결합 구체적으로 정의 절차를 필요로하고있다. 위에서 설명한 기술의 주요 자산 세포 수백 후각 시스템의 대부분은 그대로 남아 준비 입체적으로 묘화되어있다. 이러한 이점은 뇌 P뿐만 아니라 염색 기법 높은 요구 넣어배상 및 이미징. 예를 들어, 셀 전기와 일시 로딩 후각 상피 세포 및 전구 세포를 대량 충돌하고, 따라서 완전한 셀룰러 네트워크의 시각화를 가능하게한다. 또한, 대신 유전자 인코딩 된 형광의 일시로드를 통해 화학 지표의 전달은 종의 잠재적으로 큰 세트에서 측정을 할 수 있습니다. AM 염료 목욕 배양 같은 다른 대안은 주로 손상 조직의 단지 몇 백 마이크로 미터를 떠나, 심각한 후각 망울에 손상을 조각에서 작동합니다. γ-사구체의 양자 신경 분포가 그대로 남아 있고 녹음 따라서 여전히 작동 시스템에서 찍은 것을 비교하여, 우리의 프로토콜에서 사용되는 전체 마운트 준비는 예를 들어 보장합니다. 마지막으로, 영상 자체가 3 차원 볼륨의 획득을 허용하는 라인 조명 현미경에 의해 수행된다. 라인 조명 현미경 가능한 최고 수집 속도 6을 제공하는 공 초점 기술 중 하나 인 </ SUP> 필요한 후각 망울의 큰 부분을 커버한다. 느리게 수집 시스템을 사용하지만, 기록 된 볼륨의 크기가 감소되어야하는 단점을 가질 수있다. 최근에는, 빠른 화상 취득하는 다른 방법이 개발되었으며, 대안 (14, 15)로서 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 라인 조명 현미경 충분한 속도와 해상도를 모두 얻을 수있는 가장 쉬운 방법 중 하나 남아있다. 여기에 적합한 이미지 설정을 선택하기위한 가이드 라인과 같은 몇 가지 정보를 다음과 같습니다. 칼슘 이미징이 두꺼운 뇌의 준비에서 내에서 수행되기 때문에, 설치가 괜찮은 confocality를 제공해야하며, 목표는 1.0 이상의 개구 수 있어야합니다. 참조 포인트에 대한, 라인 조명 현미경으로 찍은 녹음 0.5-1 공기 단위 핀홀 크기 표준 레이저 주사 현미경으로 촬영 된 영상에 대응한다. 빠른 획득 속도가 바람직하다. 20 ㎛의 두께를 갖는 볼륨 적어도 5리터 적용즈 100 μm의 × 100 μm의 관점의 측면 필드 및 0.5 ㎛ 이하의 화소 크기는 스택 당 1 Hz의 최소 속도로 스캔한다. confocality를 감소시키는 것은 계산의 광자의 양을 증가시키고 필요에 따라서 빠른 획득을 가능하게하지만, 더 포커스 아웃 광을 기록하는 단점이있다. 이러한 접근은 광학 슬라이스의 두께가 증가하기 때문에, 실제로 ACI (6)의 도포 후 다른 Z 플레인 통해 돌기의 추적을 용이하게 할 수있다.
필요한 도구는 광범위하게 여기 제시 후각 망울 네트워크에서 온도 처리를 공부합니다. 온도 – 유도 활성 칼슘 민감성 염료 및 신호 도착 및 γ-사구체 벗어나지 모두를 통하여 상기 제 1 및 제 2 차 뉴런에 기록된다. 또한, 범위는 개별 승모판 세포는 모두 화학 물질 및 온도 정보가 평가 될 수 처리합니다. 준비 레아 이후후각 망울 그대로 VES, 후각 처리에서의 신경 분포의 양자의 역할을 더욱 조사 할 수있다. 절차는 또한 후각 네트워크 (5)를 중복으로 인코딩하는 방법 서모 및 chemoinformation 여부 및 공개에 유용합니다. 마지막으로, 전술 한 기술은 후각 망울의 온도 반응 연구에 한정되는 것이 아니라 후각 시스템의 일반적인 평가 대형 입체 볼륨 특히 셀룰러 처리 네트워크에 적용될 수있다. 일시로드 및 활동 상관 영상은 서로 다른 뇌 네트워크 (16)에 적용하고, 관찰하고 신경 세포의 수십의 활동을 비교 할 수있는 강력한 도구입니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
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