アフリカツメガエルのオタマジャクシを持つすべての実験は、動物実験における倫理のゲッティンゲン大学委員会によって承認されたガイドラインに従って行いました。 1.エレクトロポ Nieuwkoopとフェーバー7に記載のステージ49-54の動物を選択してください。 記録のセットアップが大きな作動距離と、少なくとも2ヘルツの周波数で20ミリ秒のために20 Vの電圧パルスを印加することができるエレクトロポレーション装置を用いて実体顕微鏡で構成されていることを確認します。それらは損傷を引き起こすことなく、オタマジャクシ '鼻孔に挿入することができるように、200μmの粗い粒径を有する2つの白金電極を介して電圧パルスを印加します。 デキストラン共役染料の結晶を準備します（ 例えば、カルシウムグリーン10kDaのデキストラン、またはアレクサフルオロ647 10kDaのデキストラン）の小滴を蒸留水約100μl中の5mg通常、配信量を溶解し、せることによってパラフィルムのシート上の乾燥2μlの。 注：結晶が1日も経たないうちに乾燥し、年以上の期間、冷凍庫で-18℃、その後保存することができます。 それが低下し、心拍数、すべての動きの損失および機械的刺激に対する応答の欠如によって特徴づけられる外科麻酔状態に達するまで、1~2分間、3％トリカインメタンスルホン酸を含有する水道水でそれらを配置することによって動物を麻酔。 純粋な水道水で10秒間麻酔動物を浸します。 ゲルクッションの上に動物を置き、それを損なうことなく、その周りに針を置くことによってそれを修正。 注：その皮膚を通して針を突っついによって、動物を固定しないでください。 優しく組織と鼻の穴の周囲を乾燥させます。 実体顕微鏡下で動物を置き、鼻孔に焦点を当てます。 wは、鼻孔の穴に一致する大きさの染料結晶を選ぶ鼻腔の1にそれを置き、それが完全に溶解するまで待つように鉗子を使用して、HICHは1分未満を取ります。結晶が小さい場合は、非半透明の高濃縮溶液を生成するまで、各キャビティ内に2または3を加えます。 オタマジャクシの皮膚や鼻の穴の1つに陽極上に陰極を配置します。 注：この特定の設定は、ステップ1.3で引用された染料に適用されます。異なる極性の染料は、染色結果は、鼻孔にカソードを配置することによって改善することができます。染料の極性がわからない場合は、両方の電極は、鼻孔（鼻孔あたり1）で同時に配置することができ、かつ極性は、単一の電圧パルス間で交互に。 刺激間隔の約0.5秒で20 V、20ミリ秒の6個のパルスを適用します。 注：小さな気泡は、電極が皮膚と鼻孔内の溶液と接触していることを条件とするエレクトロポレーション中に鼻孔に電極の周囲に表示されます。気泡が表示されていない場合は接続ケーブルを確認し、必ず電気穿孔のdevicを作りますeは所望の電圧パルスを提供しています。 第二の鼻孔のための手順（1.9から1.11）を繰り返します。 室温で水道水で満たしたビーカー中にエレクトロオタマジャクシを転送します。動物が意識を取り戻し、その水泳を再開するまで5〜10分待ちます。それをフィードし、それは色素が嗅球に嗅神経に沿って搬送される間に、少なくとも1日で回復しましょう​​。 最良の撮像結果のためのエレクトロポレーション1-7日以内にエレクトロポレーションし、動物を使用してください。撮影前に、色素の輸送と回復のために少なくとも24時間の時間を与えます。 2.全体のマウントの準備すべての動きが停止していないと、それはもはや機械的刺激に応答するまで3％トリカインメタンスルホン酸を含む水道水で動物を麻酔。 実体顕微鏡下でゲルクッションにオタマジャクシを移し、FOの各側面に皮膚を通して針を突っついてそれをしっかりと固定しますrebrain。 その脊髄を切断することによってオタマジャクシを生け贄に捧げます。 鼻腔、嗅神経および嗅球（ 図1A）の両方を含む組織のブロックを分析するメスを使用してください。近い左の鼻孔-なしit-と終脳、間脳境界線まで左嗅神経と球根と一緒に切断前方刃を動かすに触れることへの最初の切開を行います。右側にも同様に行います。終脳に最終的なカット後部を行うことで、神経系の残りの部分から準備を分離します。 オタマジャクシの体を処分し、脳の準備の腹側を上に向くように慎重に逆さまに組織ブロックを反転。 嗅神経の間に2本の針を挿入することにより、再び組織ブロックをピン。 カエルリンゲル液の滴を入れて（98 mMのNaClを、2のKCl、1mMのCaCl 2を、2のMgCl 2、5 mMグルコース、5 mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのpHを7.8に調整HEPES、osmola組織上の230オスモル/ Lのリティ）。 細かいハサミを使用して、3つの切開を行うことで、軸索のソートゾーンをカバーする髄膜および嗅球を削除します。電球への嗅覚神経の入口点（軸索仕分けゾーン）まで左嗅球に沿ってcaudorostrally密接にカットし、組織ブロックの後縁から出発。 右半球のための手順を繰り返し2.8。 ピンセットで髄膜を上げ、軸索仕分けゾーンで以前のものに垂直に、第三のカットを行います。 注：嗅球の腹側は、イメージングおよびボーラスロード用アクセスできるようになりました。 透過光像の画質を向上させるために、背側の手順を繰り返します。これらの追加の手順は、ボーラスロード用のマイクロピペットのナビゲーションを容易にするが、厳密には必要ではないことができます。 さらに処理およびイメージングのためにカエルリンガーで満たされた記録チャンバーにサンプルを転送します。 sのメイク腹側が上向きとナイロン繊維のネットでサンプルを確保していることUREは小さなプラチナフレームの上に張ら。 刺激のより容易なアプリケーションのためのナイロン繊維の1の上に鼻腔を置きます。 3.ボーラスのロード AM色素の原液を調製する（w / v）のプルロニックF-127の20％を含有するジメチルスルホキシド（DMSO）20μlにカルシウムAM色素（ 例えば、フルオ8 AM）を50μgを溶解します。 1-2μlの容量の小さなアリコートで原液をフリーズします。ストック溶液は、少なくとも半年間安定であるが、凍結融解サイクルを避けます。 マイクロピペットプラーを使用して、5-8MΩの抵抗及び1-2ミクロンの先端径でピペットを引き出します。 250〜500μMの濃度でカエルリンゲル液中の色素の準備原液を溶解させます。 多剤耐性トランスポーターをブロックするために、500μMの濃度に達するようにMK571を追加します。 細長いピペットチップを用いて、10μlの溶液でマイクロピペットを記入し、マイクロピペットをフリックして、すべての気泡を除去。 ピペットホルダーにマイクロピペットをマウントし、圧力が注射器または空気圧薬剤吐出装置を手動で適用され、ゲージで適用される圧力を監視することができることを確認してください。 可能であればマイクロピペットチップからの流出を可視化し、調整することができるように、注入された色素を励起する能力を備えた顕微鏡のセットアップを使用しています。理想的には、共焦点イメージングのセットアップを使用しています。組織はマイクロピペットで到達することができるように浸対物レンズと正立顕微鏡を使用してください。 顕微鏡下で全体のマウントの準備を置き、電球まで嗅神経に従うと、嗅球への関心の領域に焦点を当てます。 準備の生存率を増加させ、色素の漏れを洗い流すために記録チャンバーを介して新鮮なリンゲル液を灌流マイクロピペットチップから。 先端は準備の吻側方向に向くよう、嗅球の表面上にピペットを下げます。 ピペットの目詰まりを防止し、静かに組織に挿入するためにマイクロピペットに小さく、一定の正圧（〜25ヘクトパスカル）を適用します。 ピペットは外側の組織層を突破した後、僧帽細胞層に吻側-背側方向に動かします。 （エレクトロポレーションによる嗅覚受容ニューロンの対比染色は、マイクロピペットの位置を調整することが有用であることに注意してください。）理想的には、所望の記録サイト50から100ミクロンの距離でピペットチップを配置します。 温度感受性γ-糸球体を染色するために、γ-糸球体のシナプス前神経網の位置から約50μm吻方エリアをターゲットにしています。 100-200ヘクトパスカルの範囲内で正圧を適用します。の大きさに応じた圧力の強さを調整しますマイクロピペットチップ。圧力が初めて適用されbrightlight照明下で目に見えるわずかな組織の動きを監視することによりピペットからの流出を確認してください。 マイクロピペットは、組織のまま約10分間一定の圧力を維持します。可能であれば成功した負荷が時間の経過とともに強度の増加に伴って目に見える細胞細胞体の染色になりますように、蛍光灯照明下でセルの負荷のため、その間に神経網を確認してください。 注：多くの場合、失敗したロードのための理由は、先端または凝集色素クラスタに入る組織にピペットの目詰まりです。静かに記録チャンバーの下面に対してその先端を破壊することにより、ピペットを救出することが可能な場合があります。しかし、ピペットチップは、数マイクロメートルを超えてはなりません。ボーラスロード中に低い圧力を加えることによって、より大きなピペット開口部を補います。 荷重の10分後、ゼロにかかる圧力を低減し、染色を確認してください。 注意：染色された領域のサイズが大幅に変動し、注入した色素、吐出部位の位置の量のようないくつかのパラメータに依存します。良い染色は、約100μm×100μmでの領域をカバーしています。 染色された面積が小さすぎる、または所望の記録部位をカバーしていない場合は、繰り返しは3.10から3.13までを繰り返します。それがまだ詰まっていない場合、次の注射のために同じマイクロピペットを使用してください。 色素取り込みおよび脱エステル化を可能にするために、任意の実験を開始する前に、最後の注射後少なくとも30分待ちます。常に新鮮なリンゲル液で記録チャンバーを灌流し続けます。 4.計測設定測定のセットアップは、3次元ボリュームを記録するために十分な速度を持つ共焦点顕微鏡で構成されていることを確認します。スタックごとに少なくとも1ヘルツの取得レートを選択します。 注：適当なセットアップがpでサンプルラインワイズの代わりにポイントをスキャンする例のライン照明顕微鏡が挙げられますOINT。このようなセットアップの簡単な実現は、以前に6に記載されています。その他のオプションは、ディスク顕微鏡を回転しています。そのような設定が利用可能でない場合は、通常のポイントスキャンセットアップをより小さい面積を測定することは可能です。 糸球体のサイズに合わせて十分に大きい容量をカバーすることができるように測定パラメータを設定します。 注：記録容量の典型的な厚さは、少なくとも5層によって覆われるべきである20μmの範囲です。 漂白のためにすべてのシナプス前の測定値を確認してください。記録された画像の平均蛍光強度は、記録の時間経過にわたって低下しないまで、レーザーパワーを調整します。 20〜30秒の漂白を超える測定のために発生する可能性が高いですが、できるだけ多くの漂白を避けるために、シナプス後側の記録のための測定時間と面積を制限します。 5.臭気アプリケーションおよび温度実験 25を注ぎます50mlチューブ中の新鮮なリンゲル液のミリリットル（以前は4℃で保存）。アイスバケットにチューブを置きます。 チューブ内に温度計のきれいなプローブを挿入することにより、冷却されたリンガーの温度を監視します。温度は、実験を開始する前に、1°Cを下回るまで待ちます。 10μMの濃度でリンゲル液に溶解したL-ヒスチジンの50ミリリットルを準備します。 チャンバー内の水の流れが刺激ソリューションのリリース時に一定かつ中断されないままであるように同時に灌流リンガーに漏斗アプリケーター8または刺激の配信を可能にする同様のアプリケーション・システムを使用してください。遠位出口が離れて嗅上皮から1mm未満になるように漏斗を配置します。 上皮とファンネルアプリケータの出口に近いデジタル温度計に接続されているのNiCr-Ni系の温度センサを配置します。記録し、視覚的に投するコンピュータへのワイヤ温度計の出力ポート小さな温度変動を反映した電圧変化を演じます。 実験を開始する前に、電圧 – 温度スケールファクタを確立するために、標準温度計に別のサーモセンサーを接続します。 記録チャンバー内浴温度を調査し、それが22℃を超えないようにしてください。 画像の取得を開始し、順次、20〜30秒の刺激間隔で電子ピペットを用いて冷たいリンゲル、L-ヒスチジンおよび室温リンガー（20-22℃）での200から400μLを適用します。刺激アプリケーションのより良い制御のために、可能な場合は、ピペットに選ばれたイメージングセットアップによって送信されたトリガ信号に刺激をリリース。再現性のある結果のためのアプリケーションプロトコルを繰り返します。 彼らは活動の相関イメージングとイメージング後の分析のために好適であるので、刺激のいくつかのラウンドで長い録音のセットを取ります。 注意：録画時間とスライスの生存率との間の妥協が持っています発見されます。 6刺激アプリケーションをカバーする約 2分の測定は、ネットワークの良い復興のための十分な活性を提供します。 6.画像処理を使用して、アクティビティに相関イメージング（ACI） プレシナプスレコーディングの画像処理冷たいリンゲル液およびヒスチジンによる刺激とのレコーディングでは、それらの異なる応答プロファイル（Kludt ら 5を参照）によって、隣接するヒスチジンに敏感な糸球体からの温度感受性γ-神経網を区別する。 ORN類は、γ-糸球体の二国間の神経支配を視覚化するために、2つの異なる色素でエレクトロポレーションされた脳の準備の記録から軸方向に最大値投影を作成します。 活動の相関イメージングを使用したポストシナプスレコーディングの画像処理（ACI） 十分な時間点での録音を選択します（10以上0フレーム）と活動のまともな量（少なくとも二つの事象）。 注：活動は、単一の僧帽細胞の過程を明らかに自発的または嗅覚刺激により活性化細胞ネットワークを明らかにするために、同じ記録中に刺激のいくつかのアプリケーションによって誘導されるいずれかであることができます。 測定された構造は、記録の時間経過にわたってこれ以上2-3よりもピクセルずつ移動どこの録音を選択してください。 注：あまりにも多くの動きとのレコーディングはKludt らシフト補正手順を適用することによって救出することができます5。 録音は漂白に苦しむかどうかを確認してください。画像全体の平均強度は、記録の時間経過にわたって低下した場合、漂白補正が必要であり、そうでない場合は次の2つのステップをスキップします。 線形回帰を実行することにより、各画素の時間トレースのための線形トレンドを計算します。 リニアcomponenを排除するために、個別に各画素からの結果を減算漂白のトン。 注：BaOおよびシルド9で説明したように代替ルジャンドルフィッティングを用いることができます。 Junek らによって記載されているように活動相関イメージングのためのステップバイステップガイド（ACI）と一緒にすぐに使用できるMATLABスクリプトをダウンロードしてください。6 注：提供MATLABスクリプトを使用する代わりに、Junek ら 6に記載されている手順に従ってください。 データ評価のために使用されるシステムのMATLABパスにダウンロードしたコンテナからファイル「aci.m '、' matVis.m 'と' aci_roiSelector.m 'を移動します。 xとyは横方向の寸法は、Z軸方向とt、時間経過を参照すると、[X、Y、Z、T] -マトリックスとして編成MATLABのユーザーのワークスペースに変数としてステップ5.8で取得した生データを読み込み。 MATLABコマンドラインから「ACI」を呼び出します。 ユーザインタフェース（UI）でその後、これが表示され、「データの準備」を選択し、結果を保存するには、データとディレクトリを含む変数を選択します。 注：UIの詳細については、マニュアルに伴うACIスクリプトを参照してください。 表示された分散マップの概要を取得するためにUIに対応するスライダーを動かすことによって測定したZ-層をスクロールします。 UIに関心領域（ROI）のサイズを入力します。僧帽細胞体のために横方向及び軸方向に5μmので10μm程度にまたがるROIを調整します。糸球体の場合は、横方向に20μmから10μmのわずかに高い値が軸方向に適切です。 注：ROIのサイズは、記録のために選択された画素のスケーリングに依存する画素数として入力されなければなりません。 CENTE上にマウスの中ボタンでクリックすることにより、周囲の僧帽細胞の各可視ソーマのためのγ-糸球体および追加の領域を含むROIを選択セル/糸球体のR。 すべての参照トレースの相関マップの計算をトリガーメインUIを閉じます。結果は自動的に保存されて表示されます。