की घ्राण बल्ब में कैल्शियम परिवर्तन की निगरानी के माध्यम से रिकॉर्डिंग तापमान प्रेरित neuronal गतिविधि<em> Xenopus laevis</em
Summary
Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
Abstract
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Introduction
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों रिकॉर्डिंग तापमान प्रसंस्करण पर लक्ष्य में Xenopus की घ्राण बल्ब टैडपोल laevis। प्रोटोकॉल दाग पहली और घ्राण बल्ब में दूसरे क्रम न्यूरॉन्स और एक नमूना तैयार करने में जो घ्राण प्रणाली मुख्य रूप से बरकरार है। इस प्रकार, तापमान के प्रति संवेदनशील γ-glomerulus के सक्रियण पर नजर रखी और उसके केमो-संवेदनशील पड़ोसी केशिकागुच्छ साथ तुलना की जा सकती है। इस glomerulus की अनूठी द्विपक्षीय इन्नेर्वतिओन प्रेतसंबंधी विभिन्न रंगों के साथ सेल electroporation द्वारा कल्पना की है। इसके अलावा, सांस में लोड हो रहा है घ्राण बल्ब के भीतर एक बड़ी मात्रा में फैले माइट्रल कोशिकाओं के धुंधला के लिए अनुमति देता है। न्यूरोनल नेटवर्क प्रसंस्करण तापमान प्रेरित संकेतों दोहराया प्रोत्साहन अनुप्रयोगों के साथ कैल्शियम माप लेने और बाद में गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग के साथ डेटा का विश्लेषण करने से पता चला है।
प्रोटोकॉल पर प्रकाश डाला गया दो परिष्कृत धुंधला प्रक्रिया dures, जो दोनों के लिए संतोषजनक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने में सतर्क हेरफेर और अभ्यास की आवश्यकता है। electroporation के दौरान पशुओं के किसी भी चोट को टाला जा सकता है, नाक में इलेक्ट्रोड स्थिति खासकर जब। बेहतर, घ्राण उपकला के साथ कोई संपर्क नहीं हो जाना चाहिए। ध्यान दें कि जानवरों को अभी भी electroporation प्रक्रिया के बाद से रह रहे हैं और उनके ठीक होने के समय को ध्यान में रखा जाना चाहिए। धुंधला electroporation का एक दौर, इस्तेमाल रंगों के प्रकार के आधार पर हो सकता है जिसके बाद भी कमजोर बनी हुई है, तो इसकी तीव्रता नाक में डाई एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है। चूंकि dextran युग्मित अणुओं और निष्क्रिय प्रसार (1-2 मिमी / 10 दिन की गति से) धीमी गति से axonal परिवहन सहित कई तंत्रों के माध्यम से ले जाया जाता है, एक और विकल्प जानवरों को छोड़ने से पहले electroporation के बाद 48 घंटे इंतजार करने के लिए है। वैकल्पिक रूप से, electroporation वसूली के एक दिन बाद दोहराया जा सकता है।
jove_content "> सांस लोडिंग डाई की राशि के बाद से एक महत्वपूर्ण कदम है माइट्रल कोशिकाओं में प्रवेश को विनियमित करने के लिए मुश्किल है और विंदुक टिप आकार और आवेदन के स्थान जैसे विभिन्न मानकों पर निर्भर करता है। एक confocal प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे प्रक्रिया की निगरानी के लिए उपयोगी साबित होता है डाई आवेदन की अवधि का समायोजन है और इस तरह की तैयारी भर में इसी तरह धुंधला परिणाम पैदा होता है। इसके अलावा, पहले से electroporated टैडपोल छोटे समूह की स्थिति (γ-glomerulus शामिल) की पहचान के द्वारा डाई आवेदन के लिए सबसे अच्छी स्थिति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सबसे माप के दौरान महत्वपूर्ण कदम दोनों पारी और नमूने के विरंजन से बचने के लिए है। शिफ्ट सावधानी से स्थिति खुर्दबीन के नीचे घंटी प्रवाह से बचा जा सकता है। रूप में ब्याज की क्षेत्र के विरंजन सीमित करने, माप समय आवश्यक करने के लिए कम किया जाना चाहिए ।कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों के साथ सांस में लोडिंग धुंधला केवल बहुत प्रदान करता हैसीमित विपरीत स्वस्थ कोशिकाओं को आम तौर पर कम कैल्शियम का स्तर है और इस प्रकार के बाद से कमजोर बेसल प्रतिदीप्ति दिखा। लागू करने गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग समान कैल्शियम संकेतों के साथ गतिविधि और प्रकाश डाला गया संरचनाओं के आधार पर विपरीत उत्पन्न करके इस सीमा में गतिरोध उत्पन्न। इस अधिग्रहण के बाद विश्लेषण विधि ब्याज (संदर्भ ट्रेस) के एक चयनित क्षेत्र के कैल्शियम संकेत और 3 डी की मात्रा में प्रत्येक व्यक्ति पिक्सेल के बीच संबंध कारक गणना करता है। इसलिए, दृढ़ता से प्राप्त परिणामों के संदर्भ का पता लगाने के रूप में चयनित गतिविधि के पैटर्न पर निर्भर करते हैं। मुख्य ध्यान माइट्रल सेल इन्नेर्वतिओन पैटर्न कल्पना करने के लिए है, तो एक संदर्भ सहज neuronal गतिविधि से निकाली गई संकेत पसंद है, और सबसे अधिक सक्रिय माइट्रल कोशिकाओं को चुनने का सबसे अच्छा परिणाम का उत्पादन होगा। माइट्रल कोशिकाओं के chemo- या थर्मामीटरों संवेदनशील नेटवर्क खुलासा करने के लिए, संदर्भ केवल या तो हिस्टिडीन या ठंडे घंटी के लिए प्रतिक्रियाओं युक्त निशान चयन किया जाना चाहिए। एक पूरे glomerulus ओ का चयनब्याज हमेशा के लिए एक स्पष्ट संदर्भ ट्रेस नहीं प्रदान कर सकता है, खासकर अगर संरचनाओं दो अलग उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए एक दूसरे के शीर्ष पर झूठ बोल रहे हैं के क्षेत्र के रूप में आर माइट्रल सेल सोम। ऐसे एक मामले में, यह अक्सर glomerulus या हित के क्षेत्र के रूप में सेल शरीर के एक छोटे क्षेत्र का चयन करने के लिए उपयोगी है।
पिछले दशकों में, electroporation एक कारगर तरीका एक या एकाधिक कोशिकाओं 11,12 दाग के रूप में वर्णित किया गया है। यहां यह विशेष रूप से घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Dextran संयुग्मित अणुओं उच्चतम क्षमता दे, और गैर कैल्शियम संवेदनशील रंगों के लिए, चयन की सीमा व्यापक है और पूरा स्पेक्ट्रम आम तौर पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 13 में इस्तेमाल शामिल किया गया है। हालांकि, कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों जो सफलतापूर्वक घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स में electroporated कर रहे हैं पल कैल्शियम हरी dextran के लिए सीमित कर रहे हैं, और अगर अब भी Fluo 4 dextran व्यावसायिक रूप से उपलब्ध। इसके अलावा, रिकॉर्डिंग मुख्य रूप से superficia लक्ष्यकेवल घ्राण बल्ब के उदर सतह पर एल परतों, के बाद से तेजी से माप तकनीक के प्रवेश गहराई तक ही सीमित है। दो photon इमेजिंग आंशिक रूप से इस सीमा को पार कर सकते हैं, लेकिन अक्सर गति का अभाव है और आगे चयन कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों की राशि प्रतिबंधित।
हम यहाँ घ्राण बल्ब में तापमान प्रेरित गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। मस्तिष्क neuropil एक तीन आयामी मात्रा तापमान की घ्राण प्रसंस्करण में शामिल जटिल सेलुलर नेटवर्क कल्पना करने के लिए के रूप में जांच होती है। घ्राण बल्ब में मापने तापमान प्रेरित गतिविधि बहुत हाल ही में सूचना दी गई है 5 और विभिन्न तकनीकों के संयोजन एक विशेष रूप से अनुकूलित प्रक्रिया की आवश्यकता है। ऊपर प्रस्तुत तकनीक का एक प्रमुख परिसंपत्ति है कि कोशिकाओं के सैकड़ों एक तैयारी जहां घ्राण प्रणाली के सबसे बरकरार है में तीन आयामों में imaged रहे हैं। ये लाभ मस्तिष्क पी के रूप में रूप में अच्छी तरह धुंधला तकनीक पर उच्च मांगों डालमरम्मत और इमेजिंग। उदाहरण के लिए, सेल electroporation और सांस में लोड हो रहा है घ्राण उपकला और बल्ब में कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में मारा, और इस तरह पूरा सेलुलर नेटवर्क के दृश्य के लिए सक्षम है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores की बजाय सांस में लोडिंग के माध्यम से रासायनिक संकेतक का वितरण प्रजातियों में से एक संभावित बड़ा सेट में माप सक्षम बनाता है। AM रंगों के साथ स्नान ऊष्मायन जैसे अन्य विकल्पों मुख्य रूप से स्लाइस जो घ्राण बल्ब गंभीर रूप से नुकसान में काम करते हैं, बरकरार ऊतक के केवल कुछ सौ माइक्रोमीटर जा रही है। इसकी तुलना में, पूरे माउंट तैयारी हमारे प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है कि γ-glomerulus की द्विपक्षीय इन्नेर्वतिओन बरकरार है और रिकॉर्डिंग इस प्रकार अभी भी एक सहकारी प्रणाली में लिया जाता है, उदाहरण के लिए सुनिश्चित करता है। अंत में, इमेजिंग में ही लाइन रोशनी माइक्रोस्कोपी 3 डी की मात्रा के अधिग्रहण की अनुमति के द्वारा किया जाता है। रेखा रोशनी माइक्रोस्कोपी confocal उच्चतम संभव अधिग्रहण की दर 6 उपलब्ध कराने तकनीकों में से एक है </ Sup> जो जरूरी हैं घ्राण बल्ब का एक बड़ा अंश को कवर करने के लिए। धीमी अधिग्रहण प्रणाली का इस्तेमाल किया है, लेकिन नुकसान यह है कि दर्ज की गई मात्रा का आकार कम किया जाना चाहिए किया जा सकता है। हाल के वर्षों में तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए अन्य तरीकों का विकास किया गया है और विकल्प 14,15 रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, लाइन-रोशनी माइक्रोस्कोपी के लिए सबसे आसान तरीकों दोनों पर्याप्त गति और संकल्प हासिल करने के लिए की बनी हुई है। यहाँ उपयुक्त इमेजिंग setups के चयन के लिए दिशा निर्देशों के रूप में कुछ जानकारी इस प्रकार है। चूंकि कैल्शियम इमेजिंग मोटी मस्तिष्क की तैयारियों से भीतर किया जाता है, सेटअप सभ्य confocality प्रदान करना चाहिए और उद्देश्यों को 1.0 या अधिक की संख्यात्मक छिद्र होनी चाहिए। एक संदर्भ बिंदु के लिए, रिकॉर्डिंग लाइन रोशनी माइक्रोस्कोप के साथ लिया 0.5-1 हवादार इकाइयों के एक पिनहोल आकार के साथ एक मानक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ लिया छवियों के अनुरूप हैं। तेजी से अधिग्रहण की गति वांछनीय है। 20 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक मात्रा कम से कम 5 एल द्वारा कवरAyers, 100 माइक्रोन x 100 माइक्रोन के दृश्य के एक पार्श्व क्षेत्र और 0.5 माइक्रोन या छोटे के एक पिक्सेल आकार ढेर प्रति 1 हर्ट्ज की एक न्यूनतम गति से स्कैन किया जाना चाहिए। confocality को कम करने में गिना फोटॉनों की मात्रा में वृद्धि कर सकते हैं और इस प्रकार यदि आवश्यक हो तो तेजी से अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है, लेकिन और अधिक जानकारी का ध्यान केंद्रित प्रकाश रिकॉर्डिंग की खामी है। हालांकि, बाद से इस तरह के एक दृष्टिकोण ऑप्टिकल स्लाइस की मोटाई बढ़ जाती है, यह वास्तव में अलग-जेड विमानों के माध्यम से dendrites की ट्रेसिंग एसीआई 6 के आवेदन के बाद सुविधा कर सकते हैं।
आवश्यक उपकरण बड़े पैमाने पर घ्राण बल्ब नेटवर्क में तापमान प्रसंस्करण का अध्ययन करने के साथ साथ प्रस्तुत कर रहे हैं। तापमान प्रेरित गतिविधि कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों और संकेतों दोनों आ रहा है और γ-glomerulus से प्रस्थान के माध्यम से पहले और दूसरे आदेश न्यूरॉन्स में दर्ज की गई है। इसके अलावा, किस हद तक अलग-अलग माइट्रल कोशिकाओं पर कार्रवाई करने के लिए दोनों रासायनिक और तापमान जानकारी का आकलन किया जा सकता है। तैयारी ए के बाद सेVes घ्राण बल्ब बरकरार, घ्राण प्रसंस्करण में द्विपक्षीय इन्नेर्वतिओन की भूमिका आगे का अध्ययन किया जा सकता है। प्रक्रिया भी खुलासा कि क्या और कैसे थर्मामीटरों और chemoinformation घ्राण नेटवर्क 5 ओवरलैपिंग में इनकोडिंग है के लिए उपयोगी है। अंत में, जैसा कि ऊपर उल्लेख तकनीक घ्राण बल्ब में तापमान प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सीमित नहीं हैं, लेकिन घ्राण प्रणाली के एक अधिक सामान्य मूल्यांकन, विशेष रूप से बड़े तीन आयामी मात्रा में सेलुलर प्रोसेसिंग नेटवर्क के लिए आवेदन किया जा सकता है। सांस में लोड हो रहा है और गतिविधि के सहसंबंध इमेजिंग, शक्तिशाली उपकरण निरीक्षण और न्यूरॉन्स के दर्जनों की गतिविधि की तुलना कर रहे हैं उन्हें अलग मस्तिष्क नेटवर्क 16 के लिए लागू कर रही है।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
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