Optagelse Temperatur-induceret neuronal aktivitet gennem Overvågning Calcium Ændringer i det olfaktoriske pære af<em> Xenopus laevis</em

Alle eksperimenter med Xenopus laevis haletudser blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er godkendt af Göttingen Universitet Komité Etik i dyreforsøg. 1. Elektroporation Vælg dyr af trin 49-54 ifølge Nieuwkoop og Faber 7. Kontroller, at opsætningen optagelse består af et stereomikroskop med en stor arbejdsafstand og en elektroporation indretning, som kan anvende spændingsimpulser på 20 V i 20 msek ved en frekvens på mindst 2 Hz. Påfør spændingsimpulserne via to platinelektroder med en ru diameter på 200 um, således at de kan indsættes i de haletudser 'næsebor uden at forårsage skade. Forbered krystaller af en dextran konjugeret farvestof (f.eks Calcium Green 10 kDa Dextran eller Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) ved at opløse den typisk leveres mængde på 5 mg i ca. 100 pi destilleret vand og lade små dråber af2 pi tørt på et ark Parafilm. Bemærk: Krystallerne tørre i mindre end en dag og kan opbevares bagefter ved -18 ° C i fryseren i en periode på over et år. Bedøve dyrene ved at placere dem i ledningsvand indeholdende 3% tricaine methansulfonat i 1-2 min, indtil den når den kirurgiske anæstesi tilstand karakteriseret ved nedsat hjertefrekvens, tab af alle bevægelser og manglende responser på mekaniske stimuli. Fordyb den bedøvede dyr i 10 sek i rent vand fra hanen. Placer dyret på en gel pude og ordne det ved at placere nåle omkring det uden at skade det. Bemærk: Du må ikke lave dyret ved at stikke nåle gennem sin hud. Forsigtigt tørre området omkring næseborene med et væv. Sende dyret under stereomikroskop og fokus på næseborene. Brug pincet til at plukke et farvestof krystal størrelse matcher næsebor hul, placere den i en af ​​de næsehulen og vent til den opløses fuldstændigt, which tager mindre end 1 min. Hvis krystallerne er mindre, tilsættes 2 eller 3 ind i hvert hulrum, indtil de producerer en ikke-gennemskinnelig høj koncentreret opløsning. Placer katoden på huden af ​​haletudse og anoden i en af ​​næseborene. Bemærk: Denne særlige indstilling gælder for de ovenfor i trin 1.3 farvestoffer. For farvestoffer med en anden polaritet, kan farvningsresultaterne forbedres ved at placere katoden i næseborene. Hvis usikker polariteten af ​​farvestoffet, kan begge elektroder placeres samtidig i næseborene (én pr næsebor), og polariteten vekslede mellem enkelt spændingspulser. Påfør seks pulser af 20 V og 20 ms med ca. 0,5 sek af stimulus interval. Bemærk: Små bobler skal vises omkring elektroden i næseboret under elektroporering forudsat at elektroderne er i kontakt med huden, og opløsningen i næseboret. Hvis ingen bobler er synlige kontrollere tilslutningskabler og sørg for elektroporering device leverer den ønskede spændingsimpuls. Gentag proceduren (1,9-1,11) for det andet næsebor. Overfør den elektroporerede haletudse i et bægerglas fyldt med ledningsvand ved stuetemperatur. Vent 5 til 10 min, indtil dyret kommer til bevidsthed og genoptager sin svømning. Foder det og lad det komme sig i mindst 1 dag i løbet af hvilken farvestoffet bliver transporteret langs lugtenerven til lugtekolben. Brug elektroporerede dyr inden 1-7 dage efter elektroporation efter de bedste imaging resultater. Giv mindst 24 timers tid til transport farvestof og inddrivelse før billeddannelse. 2. Hele Mount Forberedelse Bedøver dyret i ledningsvand indeholder 3% tricaine metan sulfonat, indtil alle bevægelser er standset, og det ikke længere reagerer på mekaniske stimulationer. Overfør haletudse til en gel pude under et stereomikroskop og ordne det stramt ved at stikke nåle gennem huden på hver side af forebrain. Ofre haletudse ved overskæring sin rygmarv. Brug en skalpel til at dissekere en blok af væv, der indeholder både næsehulen, de olfaktoriske nerver og olfaktoriske pærer (figur 1A). Gøre det første snit tæt på venstre næsebor-uden at røre det-og flytte klingen fremad skæring ved siden af ​​den venstre olfaktoriske nerve og pære, indtil telencephalic-diencephalic grænse. Gøre det samme på højre side. Isoler præparatet fra resten af ​​nervesystemet ved at lave en endelig snit posterior til telencephalon. Bortskaffe kroppen af ​​haletudse og omhyggeligt flip vævsblokken hovedet, så at den ventrale side af præparatet hjerne vender opad. Pin vævsblokken igen ved at indsætte to nåle mellem de olfaktoriske nerver. Sæt en dråbe Frog Ringer-opløsning (98 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glucose, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, indstillet til pH 7,8, osmolakerhed 230 mOsmol / l) på vævet. Fjern meninges dækker Axon sortering zone og de olfaktoriske pærer ved at gøre tre indsnit ved hjælp af fine sakse. Startende fra den bageste kant af vævet blok, skåret caudorostrally tæt langs venstre lugtekolben indtil indgangspunktet af de olfaktoriske nerver i pærerne (Axon sortering zone). Gentag trin 2.8 for højre hjernehalvdel. Hæv meninges med pincet og gøre den tredje snit vinkelret på de tidligere på Axon sortering zone. Bemærk: Den ventrale side af olfaktoriske pære er nu tilgængelig for billedbehandling og bolus lastning. For at forbedre billedkvaliteten i det lys billede, gentag proceduren for den dorsale side. Disse ekstra trin kan lette navigationen af ​​mikropipetten for bolus lastning, men er ikke strengt nødvendigt. Overfør prøven til en optagelse kammer fyldt med Frog Ringer til yderligere behandling og billeddannelse. Foretag sure, at den ventrale side vender opad og fastgør prøven med et net af nylonfibre spændte over en lille platin ramme. For en lettere anvendelse af stimuli placere næsehulen på toppen af ​​en af ​​nylonfibre. 3. Bolus Loading Opløs 50 ug af calcium AM farvestof (f.eks Fluo-8 AM) i 20 pi dimethylsulfoxid (DMSO) indeholdende 20% Pluronic F-127 (w / v) for at fremstille en stamopløsning på AM farvestof. Frys stamopløsninger i små portioner af 1-2 pi volumen. Stamopløsningen er stabil i mindst et halvt år, men undgå fryse-tø cykler. Brug en mikropipette aftrækker og træk pipetter med en modstand på 5-8 MQ og en spids diameter på 1-2 um. den fremstillede stamopløsning af farvestoffet i Frog Ringers opløsning opløses ved en koncentration på 250-500 uM. Tilføj MK571 at opnå en koncentration på 500 uM til at blokere multilægemiddelresistens transportører. Fyld mikropipette med 10 pi af løsningen ved hjælp af en langstrakt pipettespids og fjerne alle luftbobler ved at stille mikropipette. Monter mikropipette i holderen pipette og sørg for, at trykket kan påføres enten manuelt med en sprøjte eller en pneumatisk stof udslyngning enhed og overvåge påført tryk med en sporvidde. Brug om muligt et mikroskop setup med evnen til at ophidse den injicerede farvestof, så udstrømningen fra mikropipettespidsen kan visualiseres og justeres. Ideelt set bruge en konfokal billedbehandling setup. Brug en opretstående mikroskop med en fordybelse målsætning, så vævet kan nås med mikropipette. Placer hele mount forberedelse under mikroskopet, følg olfaktoriske nerve indtil pæren og fokus på det område af interesse i det olfaktoriske pære. Perfundere frisk Ringer løsning gennem optagelsen kammer for at øge rentabiliteten af ​​præparat og udvaske farvestoffet utætfra mikropipettespidsen. Sænk pipette på overfladen af ​​lugtekolben, med spidsen pegende ind rostralt retning af præparatet. Anvende en lille og konstant positivt tryk (~ 25 hPa) til mikropipetten at forhindre tilstopning af pipetten og forsigtigt indsætte det i vævet. Når pipetten har overtrådt de ydre væv lag, flytte den i en Rostro-dorsal retning i mitral cellelag. (Bemærk, at en tæller farvning af olfaktoriske receptor neuroner ved elektroporering er nyttigt at justere mikropipette position.) Ideelt placere pipettespidsen i en afstand af 50-100 um fra den ønskede optagelse site. Til farvning af temperaturfølsomme γ-glomerulus, målrette mod et område omkring 50 um rostrally fra positionen for den præsynaptiske neuropil af γ-glomerulus. Påfør et positivt tryk i området fra 100-200 hPa. Justere trykket styrke afhængig af størrelsen afmikropipettespidsen. Bekræft udstrømningen fra pipetten ved at se for mindre væv bevægelser synlige under brightlight belysning når trykket er anvendt for første gang. Opretholde et konstant tryk i ca. 10 minutter, idet mikropipette forbliver i vævet. Hvis det er muligt, skal du kontrollere neuropil i mellemtiden for celle lastning under fluorescerende belysning så vellykket belastning vil resultere i synlige celle somata farvning med stigende intensitet over tid. Bemærk: Ofte årsagen til mislykket læsning er pipette tilstopning på grund af væv ind i spidsen eller aggregerede farvestof klynger. Det er nogle gange muligt at redde pipetten ved forsigtigt at bryde dens spids mod den nedre overflade af optagelsen kammeret. Imidlertid bør pipettespidsen ikke mere end nogle få mikrometer. Kompensere større pipette åbninger ved at anvende lavere tryk under bolus lastning. Efter de 10 minutter som indlæsning, reducere det påførte tryk til nul og tjekke farvning. Note: Størrelsen af ​​det farvede område varierer betydeligt og afhænger af flere parametre som mængden af ​​indsprøjtet farvestof og placering for udslyngning site. En god farvning dækker et område på omkring 100 um x 100 um. Hvis de farvede område er for lille eller ikke dækker den ønskede optagelse webstedet Gentag trin 3,10-3,13. Brug den samme mikropipette til den næste injektion, hvis den endnu ikke er tilstoppet. Vent mindst 30 minutter efter den sidste injektion, før du starter nogen eksperimenter for at tillade farvestof optagelse og deesterificering. Fortsæt med at perfundere optagelsen kammeret med frisk Ringer-opløsning på alle tidspunkter. 4. Måling Indstillinger Sørg for, at målingen setup består af en konfokal mikroskop med tilstrækkelig hastighed til at optage tredimensionelle mængder. Vælg et opkøb på mindst 1 Hz pr stak. Bemærk: Egnede opsætninger omfatter for eksempel line-belysning mikroskoper scanning prøven line-wise i stedet for punkt ved pFælles. En enkel realisering af en sådan opsætning er tidligere blevet beskrevet 6. Andre muligheder er spinning disk mikroskoper. Hvis en sådan opsætning er tilgængelig, er det stadig muligt at måle mindre områder med en normal point-scanning setup. Indstil måleparametre således at et volumen stor nok til at passe til størrelsen af ​​en glomerulus kan dækkes. Bemærk: Den typiske tykkelse en optagelse volumen i området fra 20 um, som bør være omfattet af mindst 5 lag. Kontroller alle præsynaptiske målinger for blegning. Juster lasereffekten indtil den gennemsnitlige fluorescensintensitet af de optagede billeder ikke falder over tidsforløbet for optagelse. Begræns måletid og område til optagelser på den postsynaptiske side for at undgå blegning så meget som muligt, selv om målinger, der overstiger 20-30 sek blegning er sandsynlig. 5. Lugt Ansøgning og Temperatur Eksperimenter Hæld 25ml frisk Ringer-opløsning (tidligere lagret ved 4 ° C) i et 50 ml rør. Glasset anbringes i en ice bucket. Overvåge temperaturen af ​​det afkølede Ringer ved at indsætte den rene probe af et termometer ind i røret. Vent, indtil temperaturen falder til under 1 ° C, før du starter eksperimentet. Forbered 50 ml L-histidin opløses i Ringer-opløsning ved en koncentration på 10 uM. Brug en tragt applikator 8 eller lignende applikationer, der muliggør stimulus levering samtidigt til perfusion Ringer så vandet flow i kammeret forbliver konstant og uafbrudt under frigivelse af stimulus løsning. Placer tragten på en sådan måde, at den distale udløb er mindre end 1 mm fra det olfaktoriske epitel. Placer en NiCr-Ni temperaturføler forbundet til en digital termometer tæt på epitel og udløbet af tragten applikator. Wire termometeret output port til en computer for at optage og visuelt disspille spændingsændringer afspejler temperatursvingninger små. Før du starter eksperimentet, tilslutte en anden termosensor til en standard termometer til at etablere den spænding-til-temperatur skala faktor. Kortlægning badtemperaturen i optagelsen kammer og sikre, at den ikke overstiger 22 ° C. Starte billedscanningen og sekventielt anvende 200-400 pi kold Ringer, L-histidin og stuetemperatur Ringer (20-22 ° C) via en elektronisk pipette med en interstimulus interval på 20-30 sek. For en bedre kontrol af stimulus ansøgningen, slipper stimulus med en trigger signal fra den valgte imaging setup til pipette, hvis muligt. Gentag ansøgningen protokol for reproducerbare resultater. Tag sæt af længere optagelser med flere runder af stimulation Da de er at foretrække for post-imaging-analyse med aktivitet korrelation billeddannelse. Bemærk: Et kompromis mellem optagetid og den skive levedygtighed harskal findes. Målinger af ca. 2 min omfattede 6 stimulus applikationer giver tilstrækkelig aktivitet til en god rekonstruktion af nettet. 6. Image Processing Brug Aktivitet Korrelation Imaging (ACI) Image Processing af de præ-synaptiske Recordings I optagelser med stimulering af kold Ringer-opløsning og histidin, skelne temperaturfølsomme γ-neuropil fra nabolandet histidin-følsomme glomerulus af deres forskellige respons profiler (se Kludt et al. 5). Opret en maksimal intensitet projektion i aksial retning fra optagelser af præparatet hjernen, hvor ORNs er elektroporeret med to forskellige farvestoffer for at visualisere den bilaterale innervation af γ-glomerulus. Image Processing af den postsynaptiske Recordings Brug Aktivitet Korrelation Imaging (ACI) Vælg optagelser med tilstrækkelige tidspunkter (mere end 100 frames) og en anstændig mængde aktivitet (mindst to begivenheder). Bemærk: Aktiviteten kan enten være spontan at afsløre de processer af enkelte mitral celler eller fremkaldt af flere programmer af stimuli i samme optagelse til at afsløre de trådløse netværk, der aktiveres af de olfaktoriske stimuli. Vælg optagelser hvor de målte strukturer bevæger ikke mere end 2-3 pixels over tidsforløbet for optagelse. Bemærk: Optagelser med for meget bevægelse kan reddes ved at anvende et skift korrektion beskrevet i Kludt et al 5. Kontroller, om optagelserne lider blegning. Hvis det gennemsnitlige intensitet af hele billedet falder over tidsforløbet for optagelse, blegemiddel korrektion er nødvendig, ellers springe de næste to trin. Beregn den lineære trend for tidskurven for hver pixel ved at udføre en lineær regression. Trække resultatet fra hver pixel individuelt for at fjerne den lineære component af blegning. Bemærk: Som det kan bruges en alternativ Legendre fitting som beskrevet af Bao og Schild 9. Download klar-til-brug MATLAB script sammen med en trin-for-trin guide for aktivitet korrelation imaging (ACI) som beskrevet af Junek et al. 6 Bemærk: Følg trinene beskrevet i Junek et al 6 som et alternativ til at bruge den medfølgende Matlab script.. Flyt filerne 'aci.m', 'matVis.m "og" aci_roiSelector.m' fra den downloadede beholderen til Matlab stien til den, der anvendes til evaluering af data. Indlæse rådata erhvervet i trin 5.8 som en variabel til Matlabs bruger arbejdsområde organiseret som en [x, y, z, t] -matrix med x og y refererer til de laterale dimensioner, Z, den aksiale retning og t, tidsforløbet . Call 'aci' fra MATLAB kommandolinjen. I brugergrænsefladen (UI)der vises, skal du vælge 'Forbered data ", og vælg derefter den variabel, der indeholder de data og en mappe, hvor resultaterne vil blive gemt. Bemærk: For en fuldstændig beskrivelse af UI se medfølgende manual ACI script. Rul gennem de målte z-lag ved at flytte den tilsvarende skyderen i brugergrænsefladen til at få et overblik over variansen kortet vises. Indtast størrelsen af ​​området af interesse (ROI) i UI. For en mitral celle soma justere ROI til at spænde omkring 10 um i den laterale og 5 um i den aksiale retning. For en glomerulus, de lidt højere værdier af 20 um på tværs og 10 um aksialt er hensigtsmæssige. Bemærk: størrelse Den ROI skal indtastes som en række pixels, som afhænger af pixel skalering er valgt til optagelse. Vælg en ROI der indeholder γ-glomerulus og yderligere områder for hver synlig soma af de omkringliggende mitral celler ved at klikke med den midterste museknap på center af cellen / glomerulus. Luk vigtigste UI, der udløser beregningen af ​​korrelationen kort til alle reference- spor. Resultatet gemmes automatisk og vises.