عزل العملاق فرجونية الكروموسومات من المعيشة البويضات من الضفادع والسلمندر
Summary
نقدم تقنيات بسيطة لعزل العملاقة الكروموسومات فرجونية النشطة transcriptionally من البويضات من الضفادع والسلمندر الحية. نحن تصف كيفية مراقبة هذه الكروموسومات "على قيد الحياة" على النقيض من مرحلة أو تفاضلي تدخل النقيض من ذلك، وكيفية اصلاحها لفلوري في التهجين الموضعي أو تلطيخ مناعي.
Abstract
وصفنا طرق لدراسة العملاقة الكروموسومات فرجونية النشطة transcriptionally (LBCs) وجدت في البويضة، أو بيضة unlaid، الضفادع والسلمندر. يمكن LBCs الفردية أن تصل إلى 1 ملم في الطول ويقيمون في نواة عملاقة، في حد ذاته ما يصل الى 0.5 ملم في القطر. حجم كبير من الكروموسومات يسمح الملاحظات لا مثيل لها من الجينات النشطة بواسطة المجهر الضوئي الضوء، ولكن في نفس الوقت هناك حاجة تقنيات خاصة لعزل نواة، وإزالة الغلاف النووي، ونشر الكروموسومات على شريحة المجهر. يتم عزل نواة البويضة، وتسمى أيضا الحويصلة الجرثومية (GV)، في وسيلة تسمح التبلور الجزئي للالأكتين النووية ويحافظ على هيكل الدقيق للLBCs. تتم هذه الخطوة يدويا تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط صائغ. وبعد ذلك، تتم إزالة الغلاف النووي، ومرة أخرى يدويا مع ملقط المجوهرات. يتم نقل محتويات النووية بسرعة إلى المتوسطة التي الدهاناتrses هلام الأكتين ويسمح للLBCs التالفة ليستقر على شريحة المجهر. عند هذه النقطة LBCs والعضيات النووية الأخرى ويمكن الاطلاع على النقيض من مرحلة أو تدخل الفرق المجهر النقيض من ذلك، على الرغم من أن التفاصيل الدقيقة يتم حجب من قبل الحركة البراونية. لارتفاع الملاحظة قرار المجهري أو تحليل الجزيئي، يتم طرد إعداد كله إرفاق LBCs الحساسة بحزم إلى الشريحة. ثم تبعتها وتثبيت وجيزة في امتصاص العرق من قبل تلوين مناعي أو التهجين. LBCs في حالة نشطة transcriptionally وحجمها الهائل يسمح التحليل الجزيئي على مستوى الجينات الفردية باستخدام متحد البؤر أو فائقة الدقة المجهر.
Introduction
معظم الفقاريات، مع استثناء ملحوظ من الجرابيات والثدييات المشيمية، وإنتاج البيض yolky كبيرة. وعلى الرغم من حجمها الهائل في بعض الأحيان، هذه البويضات هي الخلايا الوحيدة التي تصل إلى البعد النهائي في حين لا يزال في المبيض من الاناث. ودعا البيض المبيض البويضات وكل عادة ما تحتوي على نواة العملاقة واحدة، والمعروف منذ أوائل القرن ال 19 كما الحويصلة الجرثومية أو ببساطة GV. 1 البويضات من الضفادع مختبر المشتركة، القيطم المورق ومداري القيطم، يصل قطرها إلى أقصى حد من 1.2 ملم و 0.8 ملم على التوالي (الشكل 1). ومشاهد عامة من البويضات الناضجة من هذه الضفادع هما 0،3-0،4 مم في القطر (أرقام 2 و 3). السلمندر وعادة ما يكون البويضات حتى أكبر ومشاهد عامة. البويضات الناضجة تماما وقنفذ البحر المكسيكي، Ambystoma mexicanum، أكثر من 2 مم في القطر وGV حوالي 0.5 مم. وهكذا، هذه النوى مرئية بسهولة بالعين المجردة ويمكنيمكن التلاعب بها في العديد من الطرق التي من المستحيل مع نوى الخلايا الجسدية نموذجية.
على قدم المساواة لافت للنظر هو حجم هائل من الكروموسومات داخل GV، وهذه حقيقة معترف بها بالفعل في نهاية القرن التاسع 19. الكروموسومات الفردية Ambystoma والسلمندر أخرى يمكن أن تصل إلى 1 ملم في الطول (أرقام 4، 5). تلك هي القيطم كبيرا أصغر، على الرغم من بأطوال تصل إلى 100 ميكرون أو أكثر، انها تفوق الكروموسومات الجسدية النموذجية لمعظم الكائنات الحية. سمة هامة من الكروموسومات بويضة هو النشاط النسخي غير عادي، مما يؤدي إلى واحدة من أهم سمات شكلية متميزة لهم – المئات من الحلقات الجانبية يقترن (الشكل 5). وتتكون كل حلقة واحدة أو عدد قليل من الوحدات النسخ أن تجميع بنشاط الحمض النووي الريبي. الحلقات تعطي بويضة صبغيات مظهر غامض، مما أدى إلى اسم كروموسوم "فرجونية" بعد سطحية بهاتشابه في الفرش المستخدمة في أوقات سابقة لتنظيف المداخن مصباح الكيروسين. 2
وتركز هذه الورقة على استخدام مشاهد عامة معزولة لدراسة LBCs والعضيات النووية (نويات والهيئات هيستون مكان، والبقع). ويمكن وصفها اثنين من تقنيات مختلفة نوعا ما. في أول تقنية، أكثر شيوعا، يتم عزل مشاهد عامة في محلول ملحي باستخدام ملقط الجواهري، وتشطف لفترة وجيزة لإزالة صفار ملتصقة، وإزالة الغلاف النووي، ومرة أخرى مع ملقط المجوهرات. محتويات الجيلاتينية، التي تحتوي على LBCs والعضيات النووية، ويسمح ليستقر على شريحة المجهر والزجاج أو ساترة. هذه المستحضرات يمكن فحص مباشرة على النقيض من المرحلة أو مدينة دبي للإنترنت المجهر. بدلا من ذلك، يمكن طرد الاستعدادات لإرفاق LBCs والعضيات إلى الشريحة أو ساترة. ويمكن بعد هذه الاستعدادات تتم معالجتها للتحليل الجزيئي مفصل من الأحماض النووية والبروتينات، في المقام الأول المناعي وfluorescenتي في الموقع التهجين (FISH). 3-7
وتتضمن تقنية الثانية عزل GV في الزيوت المعدنية. تبقى 8 مشاهد عامة معزولة النفط النشطة transcriptionally لساعات طويلة ومفيدة محتملة للدراسات التي يكون فيها أحد يريد محتويات النووية ليكون نابض بالحياة قدر الإمكان. 9،10 لأن معامل الانكسار من "ساب" النووي هو قريب من ذلك من LBCs وغيرها من العضيات النووية (الشكل 3)، وتقنيات مجهرية يمكن أن يكون تحديا مع مشاهد عامة معزولة للنفط.
أخيرا، بسبب حجمها وسهولة التلاعب، ومشاهد عامة هي المادة المثالية للدراسات على الغلاف النووي. وقد وصفت مجمع المسام النووي أولا من الدراسات المجهرية الإلكترون على المظاريف GV البرمائيات 11 وأكثر الملاحظات superresolution الأخيرة استخدمت نفس المادة. 12،13
Protocol
Representative Results
Discussion
وتمت هذه الملاحظات الأولى من LBCs "الحياة" من مشاهد عامة معزولة يد الضفادع والسلمندر قبل نحو 80 سنوات من قبل عالم الأحياء الأمريكي وليام Duryee، 19 قبل إدخال النقيض من مرحلة ومدينة دبي للإنترنت المجهر، قبل المناعية الفلورسنت، وقبل FISH. مزايا LBCs للتحقيق في تفاصيل ه…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
