Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Adrienne C. Greene; Darryl Y. Sasaki; George D. Bachand

doi:10.3791/54051

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bio-ingénierie

Het vormen van Giant-sized polymeervesicles Met behulp van Gel-geassisteerde Rehydratatie

Published: May 26, 2016

doi:

10.3791/54051

Adrienne C. Greene¹, Darryl Y. Sasaki², George D. Bachand¹

¹Center for Integrated Nanotechnologies,Sandia National Laboratories, ²Biological and Engineering Sciences,Sandia National Laboratories

Summary

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Abstract

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).

Introduction

Oprichting van synthetische cel-en kleinbedrijf, grote unilamellaire blaasjes (GUVs) is van toenemend belang in de in vitro reconstructie van verschillende cellulaire processen om een kader voor de vorming van een kunstmatige cel-achtig systeem ^1,2 bouwen. Terwijl GUVs samengesteld van lipide membranen zijn uitstekend nabootst van natuurlijke, biologische membranen, ze instabiel zijn tegen milieu-fluctuaties en hebben een vrij korte houdbaarheid. Door deze beperkingen zijn amfifiele blokcopolymeren toegepast als lipiden nabootst polymeer blaasjes of polymeervesicles vormen. In dit verband polymeervesicles voordelig bij de ontwikkeling van biomimetische celsystemen gezien hun hogere stabiliteit ^3, chemische veelzijdigheid ^4,5 en aanpasbaar fysieke eigenschappen ^{^{^6-8.}}

De huidige methoden voor het vormen van giant-sized polymeervesicles omvatten electroformation ⁹ en templated rehydratatie ^10, beide which zijn tijdrovend, arbeidsintensief, vereisen gespecialiseerde apparatuur en produceren van lage opbrengsten van intacte reus polymeervesicles. Een eenvoudige gel-ondersteunde rehydratie methode werd recent ontwikkeld voor de productie van lipide GUVs ^11. Hier beschrijven we een aanpassing van de gel-geassisteerde rehydratatie techniek om grote polymeervesicles met verschillende polymeersamenstellingen gecontroleerde grootte en buffer in verschillende composities.

Kort samengevat, 1% w / v van standaard DNA agarose gelelektroforese films ontwaterd op een glazen dekglaasje. Polymeeroplossingen bereid in chloroform worden vervolgens verspreid over het uitgedroogd agarose film en verdampen. Na volledige verwijdering oplosmiddel worden polymeerfilms gerehydrateerd in de buffer naar keuze met een lichte verwarming (40-70 ° C) en grote (> 4 pm) formaat polymeervesicles worden gevormd binnen 30 minuten. Deze methode snel produceert honderden volledig intact, goed gevormde polymeervesicles met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en Reagents tegen minimale kosten.

Figuur 1. Schematische afbeelding van de gel-ondersteunde rehydratatie methode. Giant polymeervesicles uit een diblokcopolymeer gevormd na ~ 30 min rehydratatie. De hydrofiele blok wordt aangeduid in magenta en het hydrofobe blok wordt aangeduid in het groen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. polymeren en Agarose Voorbereiding Opmerking: handschoenen en een laboratoriumjas moeten worden gedragen ten alle tijden in dit protocol. Veiligheidsbril worden eveneens tijdens het werk met elk organisch oplosmiddel of een stadium met mogelijke spatten vereist. Bereid een 5 mg / ml oplossing van het polymeer in chloroform. Voeg 1 ml chloroform tot 5 mg vast poly (ethyleenoxide) – b- poly (butadieen) (PEO-PBD, EO 22 -bd 37) diblokcopolymeer in een glazen flesje en zwenk om volledig oplossen. Voer alle stappen met behulp van chloroform in een chemische dampkap. Meng een fluorescent gelabelde lipiden (al aangeschaft in chloroform opgelost) en een 0,5 mol% eindconcentratie in 99,5 mol% unlabeled polymeer. Bijvoorbeeld pipet ~ 12 ul van een 1 mg / ml fluorescerend gemerkte lipiden in chloroform in 997,58 ui PEO-PBD, EO 22 -bd 37 polymeer in chloroform (met een molecuulgewicht van 2950 Dalton) voor een uiteindelijke concentratie van 0.5 mol% gelabelde lipiden gemengd en 99,5 mol% polymeer. Winkeloplossing in een luchtdichte flacon met chloroform- resistente deksel bij -20 ° C. Wikkel loodgieters tape op flacon rand waar het deksel schroeven op het flesje en zet het deksel op de flacon. Wikkel ander stuk loodgieters tape aan de buitenzijde van het deksel en tenslotte Parafilm wikkel aan de buitenzijde van de band minimale verdamping zorgen. Maak een 1% w / v agarose oplossing door het mengen van 0,5 mg standaard agarose in 50 ml water (of 50 ml 100 mM sucrose) in een 250 ml Erlenmeyer kolf. Kook de agarose oplossing in een standaard magnetron gedurende ~ 1 min (of totdat het volledig is opgelost Zoals de vereffening van de oplossing). Opmerking: De agarose oplossing kan worden gebruikt na enkele minuten koelen of te stollen, opgeslagen en opnieuw gesmolten volgens dezelfde procedure. 2. Agarose Filmvoorbereiding Snijd het einde weg van een 1000 ui pipet tip om verstoppingen te voorkomen. Met behulp van de cut tip, pipet 300 ul van gesmolten agarose oplossing op een 25 mm vierkante glazen dekglaasje rechtstreeks van de fabrikant. Laat de agarose afkoelen tot ~ 65-75 ° C vóór depositie. Als de agarose te koelen, zal het beginnen klonteren op het oppervlak tijdens het verspreiden proces. Omgekeerd, als de agarose te warm is, zal meer nodig verspreiding naar de agarose aan het oppervlak hechten. Houd alleen de rand van het dekglaasje met handschoenen aan en gebruik de lange zijde van een 1000 pi pipetpunt de agarose gelijkmatig over het oppervlak van het dekglaasje verspreid. Verplaats de pipetpunt heen en weer over het dekglaasje totdat de agarose volledig voldoet aan en dekt het dekglaasje. Plaats de met agarose gecoate dekglaasje op een stuk Parafilm de agarose naar boven. Zodra het gewenste aantal dekglaasjes bekleed, plaatst de Parafilm de dekglaasjes in een 37 ° C incubator om de agarose drogen op het oppervlak ten minste 1 uur. Opmerking: Uitdrogingwordt bepaald door het verdwijnen van de zichtbare laag van agarose; het dekglaasje moet kijken plat en duidelijk. Zodra de films volledig gedehydrateerd, opslag dekglaasjes met agarose boven gericht in een wegwerpbare plastic petrischaal. 3. Polymer Film Formation Pipetteer 30 ul bereide polymeeroplossing op de agarose film. Houd alleen de rand van het dekglaasje met handschoenen aan en gebruik de lange zijde van een 18 G naald om de oplossing in de agarose films met een draaiende beweging verspreiden verspreiden. Verder verspreiden tot de oplossing ingedampt. Let op: Wees voorzichtig met het scherpe uiteinde van de naald. Plaats de polymeerfilms in een plastic petrischaal polymeer naar boven en zet de petrischaal in een standaardhuis vacuümexsiccator bedekt met aluminiumfolie (tot fotobleken van de gelabelde lipiden voorkomen) gedurende ten minste 1 uur om eventueel achtergebleven oplosmiddel volledig te verwijderen. 4. Vorming van Polymersomes Hechten een coverwell, ofwel een zelfgemaakte polydimethylsiloxaan (PDMS) en (een ~ 0,5 cm dik blok genezen PDMS met ~ 1 cm diameter van de middelste geslagen out) of een in de handel ook beschikbaar voor het dekglaasje bekleed met de polymeerfilm. Druk op de coverwell voorzichtig op de met polymeer beklede dekglaasje met het polymeer naar boven totdat een goede afdichting wordt gevormd tussen de coverwell en het dekglaasje. Wees voorzichtig niet te hard te drukken en breek het dekglaasje. Voeg 200-500 ul rehydratatieoplossing (water is goed, maar een reeks buffers of media werkt ook) naar de kamer (rehydratie volume afhankelijk van de grootte van de coverwell gehecht). Een bevochtigingskamer om verdamping van de rehydratatie oplossing verminderen. Plaats een opgerolde, natte Kimwipe langs de randen van een glazen petrischaal. Plaats de polymeerfilm met de gehechte coverwell in de vochtige kamer en dek af met een deksel. Dek de petrischaal met aluminiumfolie om fotobleken te minimaliseren. Plaatsde petrischaal op een hete plaat die op 40 ° C gedurende ten minste 30 min. Regel de temperatuur van de verwarmingsplaat tijdens rehydratatie 24-70 ° C afstemmen van de grootte van de vesicles (figuur 5). 70 ° C ligt in de buurt van de T m van de agar dus voorzichtigheid is geboden bij het verder gaat dan deze temperatuur. 5. Karakterisering van polymeervesicles door Fluorescence Recovery na Photobleaching (FRAP) Beweeg het dekglaasje met de gehechte coverwell direct op een omgekeerde microscoop voor beeldvorming. Kies de juiste filter set op basis van de fluorescerende lipide opgenomen in de polymeeroplossing. Voor Rhodamine-gelabelde lipiden gedoteerd in de polymeeroplossingen, gebruik dan een 560/25 nm excitatie filter en een 607/36 nm emissie filter, of vergelijkbare filter sets. Gebruik een 100x olie doelstelling bijzondere aandacht op het bovenoppervlak van het dekglaasje waar de polymeervesicles worden nageleefd. Als de polymeervesicles bijzondergrote (> 20 urn) of als de polymeerfilm te dik is, zou een lager vermogen doel (bijvoorbeeld 40X) worden gebruikt om beter zichtbaar polymeersomen. Identificeer de polymeervesicles met behulp van fluorescentie microscopie. Identificeer polymeervesicles door de karakteristieke holle, bolvormige vesikels met een diameter> 5 urn. Karakteriseren membraan vloeibaarheid met behulp van fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) op een fluorescentiemicroscoop met een verstelbare condensor. Als gevolg van de hechtende aard en de strakke verpakking van polymeervesicles op de substraten, wordt de natuurlijke beweging van de polymeervesicles beperkt, het verhogen van FRAP beeldkwaliteit. Focus de microscoop op de polymeersomen van belang. Sluit de condensator een kleine regio en zorgen dat de rand van een polymeersomen binnen het beeldgebied van belang. Verhoog de belichting camera en zorgen dat alle neutrale dichtheid filters worden verwijderd om de regio van belang effectief photobleach. Laat de folie fl fluorescentie intensiteit photobleach 30-60 seconden of totdat de fluorescentie-intensiteit aanzienlijk verminderd. Schakel de lamp en de condensor volledig open. Verlaag de blootstelling terug naar de startpositie instellingen en beginnen direct vastleggen van beelden om de 30 seconden voor 3 min. Bereken membraan diffusie coëfficiënten middels standaardwerkwijzen 12. Als het gebleekte gebied herwint fluorescentie-intensiteit in de 3-5 min, dit betekent dat het membraan fluïdum. 6. Karakterisering van polymeersomen Size Figuur 6. Werkwijze voor de grootte analyse van polymeervesicles gebruik van beeldbewerkingssoftware. Stap-voor-stap instructies over hoe de diameter van de blaasjes gevormd meten. De gebruiker moet de kalibratie-eenheden in pixels / um van de microscoop gebruikt kennen.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Open de verkregen beelden van polymeervesicles in beeldanalyse software 13. Zet de schaal voor de afbeelding door te klikken op de doos analyseren drop-down en het klikken op "SET scale". Kalibreer de schaal voor de microscoop met behulp van standaard methoden (dwz een micrometer). Vul het kalibratie-eenheden in en klik op "ok". Klik op de lijn gereedschapskist en trek een lijn verspreid over de diameter van een blaasje. Verzamel de lengte metingen door te klikken op de doos analyseren drop-down en te klikken op "maatregel". Blijven meten individuele vesicles volgens de bovenstaande procedure en elke nieuwe meting wordt toegevoegd aan het venster meetgegevens. Druk op 'Ctrl + D "na het trekken elke lijn en het meten van de lengte van de lijn op de afdrukimage waardoor het makkelijker om bij te houden welke blaasjes zijn geanalyseerd.

Representative Results

Polymeervesicles werden gevormd onder toepassing van de bovenstaande procedure (figuur 1) en de gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur figuur 2 geschetst. Polymeervesicles werden gerehydrateerd met gedeïoniseerd water (Figuur 3) en afgebeeld op een omgekeerde microscoop in epifluorescentie met een 100x olie doelstelling. Merk op dat als polymeervesicles niet zichtbaar, zij zouden hebben op maten te groot te vangen met een 100x olie doelstelling gevormd; een lager vermogen doelstelling moet mogelijk worden gebruikt. Een van de voordelen van gel-ondersteunde rehydratatie is de veelzijdigheid van het vormen polymeersomen in verschillende rehydratatie oplossingen. Polymeervesicles succesvol gevormd in gedeïoniseerd water, een volledige zoogdiercel kweekmedium sucrose oplossingen en twee fysiologisch relevante bufferoplossingen (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)), zie figuur 4. Onder standaardomstandigheden (rehydratiemet water bij 40 ° C gedurende 1 uur), zijn meer dan ~ 70 polymeervesicles typisch zijn per 40 x 40 urn 2 gezichtsveld. Terwijl het oppervlak productie van polymeervesicles niet homogeen is, zijn er tientallen velden van mening met deze representatieve opbrengst. Bovendien polymeervesicles waren stabiel in oplossing gedurende tenminste 24 uur. Polymeervesicles grootte werd gemakkelijk afgestemd door hydrateren polymeer films bij verschillende temperaturen. Polymeervesicles gevormd in gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur had een gemiddelde diameter van 2,9 ± 0,7 pm. Naarmate de temperatuur stijgt tijdens rehydratatie, de gemiddelde grootte van de polymeervesicles verhoogt (Tabel 1). Bij hoge temperaturen (> 60 ° C), polymeervesicles gevormd met afmetingen nog groter dan 100 um (figuur 5). Alle beeldverwerking werd voltooid met behulp van open-source imaging software (Figuur 6).Verzamelde beelden werden geopend in het softwareprogramma. De geijkte pixelgrootte is in te stellen schaal wordt ingevoerd. Met behulp van de line tool, werden lijnen getrokken over de diameters. Na elke afzonderlijke lijn werd getrokken, werd het geijkt lengte gemeten en toegevoegd aan de doos resultaten. Gegevens kunnen vervolgens worden uitgezet in de wiskundige software naar keuze (bijvoorbeeld Excel, Prism, Oorsprong, etc.) . Figuur 2. Foto conventionele en goedkope nodig voor de vorming van polymeersomen De benodigde items labo materialen zijn: Parafilm, een 18,5 G naald polymeer in chloroform of andere geschikt oplosmiddel, een 1000 pi pipetpunt, een Erlenmeyer pincet, agarose, 25 mm vierkant dekglaasjes, PDMS imaging waterputten en een glazen petrischaal. klik hier ombekijk een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3. Foto's van de gel bijgestaan rehydratatie methode. Agarose Opgelost is verspreid over een 25 mm vierkante dekglaasje totdat een gelijkmatige film lagen de hele dekglaasje. Coverslips worden vervolgens in een 37 ° C incubator te zetten en film is uitgedroogd. Een polymeeroplossing wordt afgezet op het uitgedroogd agarose film en verspreiden met behulp van een naald in een cirkelvormige beweging. Het dekglaasje wordt dan plaats in een exsiccator O / N om volledig elk oplosmiddel resten verdampen. Tot slot, en imaging kamer is gehecht aan het substraat en polymeren worden gehydrateerd met een oplossing van de keuze en geplaatst in een petrischaal bij 40 ° C gedurende ten minste 25 min te staan voor de vorming van polymeervesicles. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur. </p> Figuur 4. polymeervesicles kan vormen in verschillende buffers. PEO-PBD polymeerfilms werden gedurende 1 uur gerehydrateerd met het aangegeven buffer bij 40 ° C. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5. Het verhogen van de temperatuur tijdens rehydratatie neemt de grootte van de polymeervesicles. Representatieve epifluorescentie beelden van polymeersomen gevormd in water bij de aangegeven temperaturen rehydratatie. Het verhogen van de temperatuur leidt tot grotere polymeervesicles. Schaal bar = 10 micrometer._blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Temperatuur (° C) Gemiddelde grootte (pm) 24 2,93 ± 0,7 40 5.76 ± 2.5 50 6.65 ± 2.4 60 11.46 ± 5.8 70 14.04 ± 7.0 Tabel 1. Het verhogen van de temperatuur tijdens rehydratatie resulteert in een verhoogde polymeersomen omvang. Gemiddeld diameters voor meer dan 100 polymeervesicles in water per andere temperatuur conditie werden berekend en worden hier afgebeeld. Fout is standaarddeviatie.

Discussion

Polymeervesicles worden steeds op grote schaal onderzocht als biologisch membraan nabootst. De robuuste en veelzijdige eigenschappen van polymeren maken ze veel aantrekkelijker voor studies die membraan functionalisering, lange levensduur en afgestemd responsiviteit. Traditionele methoden voor het vormen van giant-sized polymeervesicles ^9,10 (> 4 micrometer) zijn arbeidsintensief en vereisen dure en gespecialiseerde apparatuur. Hier presenteren we voor de eerste keer, een snelle, veelzijdige en robuuste werkwijze voor het vormen gigantische polymeervesicles toepassing van standaard laboratorium- goedkope reagentia en apparatuur.

Middels gel-geassisteerde rehydratie, kunnen unilamellaire polymeervesicles snel worden gevormd (<30 min), in diverse rehydratatie oplossingen (waaronder celcultuur media) en met een verscheidenheid van verschillende polymeren (gegevens niet getoond). De vorming van multilamellaire vesicles of asymmetrische werd niet waargenomen met deze techniek. In dit werk, gebruikten we poly (ethyleenoxide) – b- poly (butadieen) (PEO-PBD, EO ₂₂ -bd ₃₇₎ neutraal diblokcopolymeer. Veel verschillende polymeersamenstellingen (inclusief gebracht diblokcopolymeren) werken goed met deze methode (niet getoond). Echter, sommige in de handel verkrijgbare triblokcopolymeren en hoger gewicht diblokcopolymeren moleculaire (~> 5000 Dalton) vormen geen aparte polymeervesicles. Voor alle experimenten in dit handschrift, een lage concentratie van gelabeld lipide werd gedoteerd in de polymeeroplossingen alleen voor visualisatie. Andere visualiseringtechnieken, waaronder polymeren direct gefunctionaliseerd met een fluorescerende kleurstof kan ook worden gebruikt. Polymeervesicles kan eveneens worden afgebeeld met heldere veld microscopie, hoewel fluorescentiemicroscopie zorgt voor een betere resolutie.

De meeste kleine wijzigingen aan het protocol meestal geen resultaten veranderen. Zo hebben kleine verschillen in de concentratie van de polymeeroplossing verspreid op de dekglaasjes niet de vorming van het polymeer f veranderenilm gevormd. Terwijl de volledige concentratietraject niet werd bepaald, zal polymeersomen vorming succesvol optreden bij een groot aantal polymeerfilm concentraties (bijvoorbeeld 1-10 mg / ml). Echter, er zijn een aantal protocol wijzigingen die een negatieve invloed hebben op polymeersomen formatie. De meest opvallende is dat de ronde glazen dekglaasjes (in plaats van vierkante) resulteren in zeer slechte vorming van polymeervesicles. We schrijven dit toe aan de extreem gelijkmatige laag van agarose op het glas die in feite de vorming van polymeervesicles belemmert.

Een van de meest opmerkelijke uitdagingen van deze techniek is de mogelijkheid om de polymeervesicles van het oppervlak herstellen met een hoge opbrengst. Er zijn bepaalde gevallen waar het verwijderen van de polymeervesicles van het oorspronkelijke oppervlak kan voordelig zijn. Door de hoge achtergrondfluorescentie van de gedroogde polymeerfilm verwijderen individuele polymeervesicles en hechten ze dekglaasjes reinigen zal beeldkwaliteit en karakterisatie verhogen (particularly tijdens FRAP analyse). Om dit, zachte pipetteren met een pipet tip waarin het uiteinde is afgesneden zal de polymeervesicles desorberen van het oppervlak (hoewel het aantal blaasjes hersteld is aanzienlijk lager dan de oorspronkelijk gevormd). Polymeervesicles kan vervolgens dekglaasje gemodificeerde oppervlakken worden geplaatst, zodat de polymeersomen om met de nieuwe dekglaasje. Kenmerkend voor neutrale PEO-PBD polymeervesicles, dekglaasjes met ozon behandeld gedurende 15 min kan de polymeervesicles te vallen naar de oppervlakte voor beeldvorming. Verschillende oppervlaktemodificatie is vereist voor verschillende polymeersomen samenstellingen (bijvoorbeeld negatief of positief geladen polymeren).

De meeste materialen gebruikt in dit protocol zijn met succes opgeslagen en gebruikt voor de dagen tot weken. De gestolde agarose kunnen keer worden gekookt en opnieuw totdat de agarose begint aggregaten zelfs na het koken of het gestolde agarose begint te drogen. Coverslips met droge agarose films kunnen worden opgeslagen en gebruiktoneindig d (bijvoorbeeld maanden). Het polymeer werd opgelost in chloroform kan enkele maanden worden bewaard bij -20 ° C. Zodra de polymeerfilm wordt gedroogd op agarose films moeten echter de films onder huisvacuüm worden bewaard en binnen twee weken (langere termijn opslag werd niet rechtstreeks bepaald maar zijn er opmerkelijke verschillen in polymeervesicles gevormd uit polymere films ouder dan twee weken).

Met behulp van de gel bijgestaan rehydratatie protocol hier wordt gepresenteerd, zijn honderden uniform-vormige polymeervesicles snel gevormd met slechts een paar uur van de arbeid met behulp van standaard uitrusting en goedkope laboratorium reagentia. Bovendien kan polymeervesicles worden gevormd in een verscheidenheid van fysiologische bufferoplossingen en uit verschillende polymeersamenstellingen (niet getoond). Kleine wijzigingen in de werkwijze geen negatieve de vorming van polymeersomen veranderen, waardoor gel ondersteunde rehydratatie een veelzijdige en toegankelijke techniek wetenschappers uiteenlopende technische eXPERTISE.

De mogelijkheid om gigantische polymeervesicles gemakkelijk van de grootte schaal van de cellen is essentieel voor het bouwen van kunstmatige cel-achtige systemen. Het gebruiksgemak en de veelzijdigheid van-gel bijgestaan rehydratatie om deze polymeervesicles maken biedt een enorme vooruitgang in de biomimetic veld voor het creëren van robuuste celmembraan nabootst. Bijvoorbeeld met behulp van deze techniek strategieën voor inkapseling van verschillende intracellulaire componenten, functionalisering van het polymeer met cel membraaneiwitten en integratie van membraan transporteiwitten, om maar een paar te noemen, kan worden ontworpen om polymeersomen-gebaseerde kunstmatige cellen bouwen.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).

Materials

125 mL Erlenmeyer flask	VWR	89000-360
18 guage needle	VWR	BD-305196
25 mm square coverslips	VWR	48366-089
Agarose	Sigma	A9539	A standard agarose for DNA gel electrophoresis
Chloroform	Sigma	288306-2L
Commerical coverwell	Electron Microscopy Sciences	70336	Press-to-Seal Silicone Isolators
Fiji Image Analysis Software	ImageJ		Free Download: http://fiji.sc/Fiji
Glass vial with Teflon Lid	VWR	66009-556	1.9mL capacity, case of 144
Liss-rhodamine B PE Lipid	Avanti Polar Lipids	810150C	1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform
Parafilm	VWR	52858-000	10.2 cm x 38.1 m
poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)	Polymer Source	P2904-BdEO	http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf
Pastic Petri Dish	VWR	25384-092
Teflon tape	VWR	300001-057	1/2" width

References

Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a., Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse – Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. J. Vis. Exp. (111), e54051, doi:10.3791/54051 (2016).