De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em> Helicobacter pylori</em> La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em> Escherichia coli</em> En modo batch

Helicobacter pylori (H. pylori) es una causa importante de gastritis y úlcera péptica. Esta bacteria también ha sido clasificado como un carcinógeno en humanos por parte de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, que forma parte de la Organización Mundial de la Salud, en el año 1994. Se ha estimado que la prevalencia de H. pylori es del 70% en los países en desarrollo y del 30-40% en los países industrializados ^1. A pesar de que la tasa de infección de H. pylori está disminuyendo en los países industrializados, la tasa de infección de H. pylori en los países en desarrollo sigue siendo alta ^2. El tratamiento estándar para erradicar H. pylori consiste en la administración de un inhibidor de la bomba de protones, IBP y dos antibióticos, claritromicina o metronidazol más amoxicilina ^3. Sin embargo, el aumento de la resistencia a los antibióticos en H. pylori relacionados con la PI terapia de úlceras insta al desarrollo de nuevas estrategias para prevenir or curar la infección. Desarrollo de la vacunación preventiva y / o terapéutica contra H. pylori podría proporcionar un enfoque alternativo para el control de H. pylori.

Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP), un importante factor de virulencia de H pylori, se identificó por primera vez en extractos de agua de H. pylori con la capacidad de activar los neutrófilos a adherirse a las células endoteliales y producir especies de oxígeno reactivas (ROS) ^4. La infiltración de neutrófilos de la mucosa gástrica se encuentra en H. pylori pacientes infectados con gastritis activa pueden resultar en la inflamación y el daño tisular del estómago. Por lo tanto, HP-NAP puede jugar un papel patológico mediante la activación de los neutrófilos para inducir inflamación gástrica, lo que hace aún más úlcera o H. pylori -asociado enfermedades gástricas. Sin embargo, HP-PAN es un candidato potencial para aplicaciones clínicas ^5,6. Debido a la pro inmunogénica e inmunomoduladorpiedades de HP-NAP, esta proteína se podrían utilizar para desarrollar vacunas, agentes terapéuticos, y herramientas de diagnóstico. Un ensayo clínico se ha realizado para el uso de HP-NAP recombinante como uno de los componentes de una vacuna de proteína contra H. pylori. Esta vacuna consiste en HP-NAP recombinante, asociado a la citotoxina gen A (CagA), y las proteínas vacuolizante citotoxina A (VacA) formulado con hidróxido de aluminio y además se ha demostrado que es segura e inmunogénica en humanos ^7. Además, HP-PAN actúa como un potente inmunomodulador para desencadenar T auxiliares de tipo 1 (Th1) -polarized respuestas inmunes para la terapia del cáncer ⁸ y para regular hacia abajo las respuestas inmunitarias mediadas por Th2 provocadas por reacciones alérgicas e infecciones parasitarias ^9,10. Como para el diagnóstico, recombinante ELISA basado en HP-PAN se ha aplicado a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP en H. pylori pacientes infectados ^11. Un estudio mostró que el nivel de anticuerpos HP-PAN-específica en sueros de H. pylori pacientes infectados con cáncer gástrico fue significativamente mayor que la de los pacientes con gastritis crónica ^12. Otro estudio también demostró que los anticuerpos séricos contra HP-NAP se asocian con la presencia de no cardia adenocarcinoma gástrico ^13. Por lo tanto, recombinante ELISA basado en HP-NAP se puede aplicar a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP para el pronóstico del cáncer gástrico en H. pylori pacientes infectados. En su conjunto, el HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.

Entre los diversos métodos utilizados para la purificación de recombinante HP-NAP expresado en Escherichia coli (E. coli) en su forma nativa informado hasta ahora, se necesita una cromatografía de filtración en gel segunda etapa de purificación que implica obtener alta pureza HP-NAP ^14-16 . Aquí, un método que utiliza cromatografía de modo por lotes negativa condietilaminoetilo (DEAE) resinas de intercambio iónico se describe para la purificación de HP-NAP sobreexpresa en E. coli con alto rendimiento y alta pureza. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP se recuperan de la fracción no unida. Este enfoque purificación utilizando cromatografía de intercambio iónico de DEAE en el modo negativo es simple y ahorrando al permitir la purificación de HP-PAN recombinante mediante cromatografía de un solo paso a través de la recogida de la fracción no unida tiempo. Además de HP-NAP, varias otras biomoléculas, tales como virus ^17, la inmunoglobulina G (IgG) ^18, la hemoglobina ^19, la proteína fosfatasa ^20, y el factor de virulencia flagelina ^21, también se han informado de que se purificó por cromatografía de intercambio de iones en negativo modo. Se prefiere el modo negativo para la cromatografía de intercambio iónico, si las impurezas son el menorcomponentes presentes en la muestra sometida a purificarse ^22. La aplicación de la cromatografía negativo en la purificación de biomoléculas naturales o recombinantes se ha revisado recientemente ^23.

El presente informe ofrece un paso a paso el protocolo para la expresión de HP-PAN recombinante en E. coli, lisis de las células, y la purificación de HP-NAP usando cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio iónico de DEAE. Si una proteína deseada para la purificación es adecuado para cromatografía de intercambio iónico en el modo negativo, el protocolo descrito también podría ser adaptado como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación.