La inyección de células de melanoma murino singénico para determinar su potencial metastásico en los pulmones

Declaración de Ética: El uso de ratones en la investigación sólo es aceptable en los casos en que podría avanzar en la comprensión humana de la biología fundamental o hacia el eventual tratamiento de la enfermedad. 1. Orden Compra hembra C57BL / 6 ratones (edad de 6 – 8 semanas), 5 ratones por grupo. Se requieren varios días para los ratones para ajustar. 2. Preparación de las células B16-BL6 Retire las placas de cultivo celular de incubadora a 37 grados y coloque en una campana estéril. Las placas deben ser aproximadamente 70% confluentes con células de melanoma murino B16-BL6. A mayor confluencia puede alterar las células potencial metastásico. Añadir 1 ml de 0,05% tripsina-EDTA por placa, dejar reposar durante 1 minuto, y luego aspirar la solución de tripsina-media. Añadir 1 ml de tripsina por placa y las placas de volver a la incubadora durante 10 min. Después de mover las placas de la incubadora a la campana estéril, añadir 4 ml de suero libre de Rosewell Parque Memorial Institute Medium (RPMI) a cada placa. Recoger las células con una pipeta estéril, motorizado. Expulsar células contra la parte inferior de la placa, con la punta presionado en un muy ligero ángulo, para romper las células. Repetir varias veces con el fin de asegurar la separación adecuada de los grupos de células, que de otro modo podrían obstruir la aguja de inyección. Recordar y transferir a un tubo cónico de 50 ml. Use un hemocitómetro para determinar la densidad celular. Mantener el número total de células B16-BL6 constante, determinar el volumen de RPMI libre de suero necesario para alcanzar concentraciones finales de 0, 0,065, 0,015, 0,25, y 0,5 millones de células / ml. Igualmente alícuota los medios de comunicación en el tubo de 50 ml a 15 ml tubos cónicos. Centrifugar los tubos cónicos a 2.250 xg durante 5 min. Decantar los medios de comunicación. Añadir un volumen apropiado de RPMI libre de suero y confirmar la densidad celular deseada a través de hemocitómetro. Ajuste densities- añadiendo RPMI adicional o hilado y resuspensión en un volumen-más pequeño en consecuencia. Alícuotas 500 lde cada suspensión celular en 1,8 ml etiquetados tubos en hielo. 3. vena de la cola de inyección Tome un ratón, que tuvo lugar por la cola, y lo guiará trasera por primera vez en el limitador del ratón. Con el torso en la cámara principal del retenedor, con la cola fuera de ella, tira del ratón hacia el final del inmovilizador. Inserte el limitador-émbolo, sin dejar de empujar hasta que el ratón es seguro. Girar el ratón 90 grados de tal manera que una de las venas de la cola lateral esté orientado hacia arriba. El uso de una almohadilla con alcohol, limpie vigorosamente el lado de la cola del ratón, en particular cuando la vena de la cola es más visible. Nota: Una buena iluminación es esencial para la visualización de la vena de la cola efectiva en 6J / B57BL. Las lámparas de calor o almohadillas de cirugía climatizada, aunque no es necesario, también ayudan a aumentar el volumen de la vena de la cola. En una campana de cultivo estéril, recoger 300 l de medio de cultivo celular del tubo de 2 millones de células / ml. Invertir la aguja, moviendo los side y empujando el émbolo, para expulsar las burbujas de la jeringa. Expulsar cultivo RPMI para dar lugar a un volumen final de 250 l. Extender el ratón de cola con la mano no dominante. Mantenga la cola con el extremo proximal de la cola elevada con el dedo índice de la mano no dominante, y la parte distal de la cola deprimido con el pulgar. Nota: En este modo, la vena de la cola se mantiene en una posición lateral, paralela a la superficie de contención, con una entrada congruente posible en la parte más distal de la cola. Insertar la aguja en la vena de la cola, hacia el extremo distal, en un ángulo descendente minutos para empezar, y luego ajustar la aguja para que coincida con el ángulo de la vena de la cola a la inserción adicional (bajando extremo del émbolo de la jeringa respecto a la aguja) . Insertar la aguja aproximadamente 1 cm en la vena de la cola. Después de la inserción, comienzan a empujar el émbolo, se mantiene la aguja constante. Nota: Si la aguja está en la vena de la cola y el extremo de la aguja es not obstruido los medios de comunicación debe fluir sin obstáculos en la vena. inyección eficaz se caracteriza por depuración de la sangre de la vena. Si hay resistencia, o una burbuja empieza a formar en el lugar de la inyección, retire la aguja e inténtelo de nuevo en una ubicación más proximal a lo largo de la vena de la cola. Retire la aguja de la vena y lo descarta. Mantenga una gasa contra el sitio de entrada para detener cualquier sangrado. Retire el émbolo del retenedor y colocar el puntero del ratón en la jaula destinatario. Repita este procedimiento para todas las demás concentraciones. Nota:. Pulmón establecimiento focos tarda aproximadamente 2 – 3 semanas, con una variabilidad dependiendo de la línea celular y el tamaño deseado de los focos 9 En el ínterin, los ratones deben ser monitorizados para detectar síntomas que podrían justificar la eutanasia temprano, como jadeo excesivo. 4. Contar el pulmón Focos La eutanasia el ratón mediante la colocación de una cámara de CO 2 y la exposición al 100% de CO2 </sub> introdujo en 10 a 30% de volumen de la cámara por minuto durante 5 minutos. Siga con una dislocación cervical. Splay el ratón sobre la espuma de poliestireno. Usando tijeras quirúrgicas, crear una incisión quirúrgica a lo largo del esternón. Haga dos incisiones adicionales, tanto de la parte superior de la incisión del esternón y la ramificación hacia los hombros del ratón, la exposición de la caja torácica. Hacer dos cortes, cada uno a lo largo de los lados laterales del esternón, para eliminar de la caja torácica del torso, la exposición de los pulmones y el corazón. Sosteniendo el corazón con pinzas quirúrgicas, cortar la tráquea y el esófago, liberando el corazón y los pulmones del ratón. Colocar debajo de un microscopio de disección, un aumento de 10x, para una mejor visualización. Diseccionar el corazón de los pulmones y retire el timo, dejando sólo los dos pulmones. Con los pulmones bajo un microscopio de disección, comenzar a contar los focos de pulmón. Cada focos debe aparecer como una intromisión circular, de color marrón en la superficie de los pulmones. porla coherencia entre los ratones, contar el número de focos en la superficie de un lóbulo, y luego invertir ese lóbulo. Hacer cada uno de los cuatro lóbulos permite individualmente para el recuento más fácil. Guardar y fijar los pulmones si se realiza IHC, de lo contrario, desechar los restos.