Injectie van Syngene muizen Melanoma Cells om hun gemetastaseerde potentieel in de longen bepalen

Ethiek Verklaring: Het gebruik van muizen in onderzoek in gevallen waar het menselijke begrip van fundamenteel biologisch of naar de uiteindelijke behandeling van de ziekte kunnen bevorderen alleen aanvaardbaar. 1. Bestellen Aankoop vrouwelijke C57BL / 6 muizen (leeftijd 6-8 weken), 5 muizen per groep. Kan enkele dagen voor de muizen te passen. 2. Voorbereiding van de B16-BL6 Cells Verwijder celkweek borden van 37 graden incubator en plaats in een steriele kap. De platen moeten ongeveer 70% samenvloeiing met B16-BL6 muizen melanoomcellen zijn. Een grotere samenvloeiing kunnen de cellen veranderen metastatisch vermogen. Voeg 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA per plaat, laat zitten gedurende 1 minuut en daarna zuig het trypsine-media oplossing. Voeg 1 ml trypsine per plaat en platen terug naar de incubator gedurende 10 minuten. Na het verplaatsen van de platen uit de incubator naar de steriele kap wordt 4 ml serumvrij Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) aan elke plaat. Verzamel de cellen met een steriele, gemotoriseerde pipet. Uitwerpen cellen tegen de onderzijde van de plaat, met de punt geperst bij een zeer geringe hoek te breken van de cellen. Herhaal dit een paar keer om een ​​goede scheiding van de cel klonten, die anders het uitwerpen naald zou kunnen verstoppen te garanderen. Herinneren en over te dragen aan een 50 ml conische buis. Gebruik een hemocytometer om de celdichtheid te bepalen. Houden het totale aantal B16-BL6 cellen constant Bepaal het volume serumvrij RPMI nodig eindconcentraties van 0, 0,065, 0,015, 0,25, en 0,5 miljoen cellen / ml bereiken. Evenzeer aliquot de media in de 50 ml buis tot 15 ml conische buizen. Centrifugeer de conische buizen bij 2250 xg gedurende 5 minuten. Schenk de media. Voeg een geschikt volume van serumvrij RPMI en bevestig de gewenste cel dichtheid via hemacytometer. Pas densities- door het toevoegen van extra RPMI of spinnen en resuspenderen in een kleinere volume- dienovereenkomstig. Aliquot 500 pivan elke celsuspensie in gelabelde 1,8 ml buisjes op ijs. 3. Tail Vein Injection Neem een ​​muis, in het bezit van de staart, en begeleiden zij achter-first in de muis weerhouder. Met de romp in de belangrijkste kamer van de weerhouder, met de staart buiten, trekt u de muis naar het einde van de weerhouder. Steek de weerhouder-zuiger, blijft druk totdat de muis is beveiligd. Draai de muis 90 graden zodat één van de laterale staartaders naar boven is gericht. Met behulp van een doekje met alcohol, krachtig reinigen van de kant van de staart van de muis, in het bijzonder wanneer de staartader het meest zichtbaar is. Let op: Goede verlichting is essentieel voor een effectieve staartader visualisatie op B57BL / 6J muizen. Warmtelampen of verwarmd chirurgie pads, maar niet noodzakelijk, zal ook het volume van de staartader verhogen. In een steriele cultuur kap, verzamelen 300 pi celkweekmedium van de 2.000.000 cellen / ml buis. Omkeren van de naald, flicking de side en duwt de zuiger, om bellen te werpen uit de spuit. Eject cultuur-RPMI te resulteren in een uiteindelijk volume van 250 pl. Uitbreiding van de muis-staart met niet-dominante hand. Houd de staart met het proximale uiteinde van de staart verhoogd met de wijsvinger van de niet-dominante hand en het distale gedeelte van de staart ingedrukt met de duim. Opmerking: Zo wordt de staartader gehouden in een laterale positie, parallel aan de restrainer oppervlak met een overeenkomende invoer mogelijk in de meer distale deel van de staart. Steek de naald in de ader staart, in de richting van het distale einde, op een minuut neerwaartse hoek om te beginnen, en pas dan de naald op de hoek van de staartader bij verder inbrengen overeenkomen (het verlagen van zuiger einde van de injectiespuit ten opzichte van de naald) . Steek de naald ongeveer 1 cm in de staartader. Na het inbrengen, beginnen om de zuiger te duwen, die de naald stabiel. Opmerking: Als de naald in de staartader en het einde van de naald not belemmerd de media moeten ongehinderd stromen in de ader. Effectieve injectie wordt gekenmerkt door een speling bloed uit de ader. Als er weerstand is, of een bel begint te vormen op de site in injectie, verwijder de naald en probeer het opnieuw op een meer proximale locatie langs de staartader. Haal de naald uit de ader en gooi hem weg. Houd gaas tegen het binnendringen site om het bloeden te stoppen. Verwijder de zuiger uit de weerhouder en plaats de muis in de kooi ontvanger. Herhaal dit voor alle andere concentraties. Let op:. Lung brandpunten vestiging duurt ongeveer 2-3 weken, met variabiliteit afhankelijk van de cellijn en de gewenste grootte van de brandpunten 9 In de tussentijd, muizen moeten worden gecontroleerd op symptomen die vroege euthanasie zou kunnen rechtvaardigen, zoals overmatig hijgen. 4. Het tellen van de Lung Foci Euthanaseren de muis door in een CO 2 kamer en blootgesteld aan 100% CO 2 </sub> geïntroduceerd op 10-30% van kamervolume per minuut gedurende 5 minuten. Volg met een cervicale dislocatie. Splay de muis op piepschuim. Gebruik chirurgische schaar, maakt een incisie langs het borstbeen. Eens twee insnijdingen, zowel vanaf de bovenkant van het borstbeen incisie en vertakking naar de schouders van de muis, waardoor de ribbenkast. Maak twee sneden, elk langs de laterale zijden van het borstbeen, de ribbenkast van de romp verwijderd, waardoor de longen en het hart. Het houden van het hart met chirurgische pincet, snijd de slokdarm en de luchtpijp, het vrijmaken van het hart en de longen van de muis. Plaats onder een dissectie microscoop bij 10X vergroting, voor een betere visualisatie. Ontleden het hart uit de longen en verwijder de thymus, waardoor alleen de twee longen. De longen onder een dissectie scope, beginnen de longen foci tellen. Ieder focus verschijnt als een cirkel, bruine het opdringen op het oppervlak van de longen. Voorsamenhang tussen muizen, tel het aantal foci op het oppervlak van een kwab en keer dan dat kwab. Doen alle vier lobben afzonderlijk zorgt voor eenvoudiger tellen. Opslaan en de longen repareren als het uitvoeren van IHC, anders gooi de overblijfselen.